ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube សម្រាប់សមាសធាតុគីមីឧស្សាហកម្មគីមី កង្វះ SPECC1L នាំទៅរកការបង្កើនស្ថេរភាពនៃសន្លាក់ spliced ​​និងកាត់បន្ថយការស្រក់នៃកោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial ។

សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube សម្រាប់ឧស្សាហកម្មគីមី

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.គឺជាក្រុមហ៊ុនផលិតឈានមុខគេដែលមានឯកទេសខាងបំពង់ដែកអ៊ីណុកគ្មានថ្នេរ, បំពង់ annealed ភ្លឺ, បំពង់ coiled គ្មានថ្នេរជាដើម។ដើម្បីសម្រួលដល់អតិថិជន យើងខ្ញុំមានលក់បំពង់ និងបំពង់ផងដែរ។Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.មានឧបករណ៍ផលិត និងសាកល្បងទំនើបបំផុត។យើងអាចបំពេញតម្រូវការរបស់អ្នកទាំងស្រុង។យោងតាមស្តង់ដារយ៉ាងតឹងរឹងបំពង់ដែលផលិតដោយយើងតែងតែមានការអត់ធ្មត់ OD និង WT ត្រឹមត្រូវ។ការត្រួតពិនិត្យការអត់ឱនគឺស្របតាមស្តង់ដារផលិតកម្មយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។ផលិតផលរបស់យើងតែងតែពេញចិត្តចំពោះអតិថិជន។អតិថិជនបានទិញផលិតផលរបស់យើងបានបង្កើតប្រាក់ចំណេញកាន់តែច្រើន។
ក) OD (អង្កត់ផ្ចិតខាងក្រៅ) : 3.18mm ដល់ 101.6mm
ខ) WT (កម្រាស់ជញ្ជាំង): 0.5mm ទៅ 20mm
គ) ប្រវែង៖ យោងតាមតម្រូវការរបស់អតិថិជន
ឃ) ស្តង់ដារ៖ ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ជាដើម។
ង) វិធីសាស្ត្រដំណើរការ៖ ERW, EFW ជាដើម។

គ្រាប់រំកិលបង្ហាញអត្ថបទបីក្នុងមួយស្លាយ។ប្រើប៊ូតុងខាងក្រោយ និងបន្ទាប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយ ឬប៊ូតុងឧបករណ៍បញ្ជាស្លាយនៅចុងបញ្ចប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយនីមួយៗ។
កោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial crest (CNCC) រអិលចេញពីផ្នត់សរសៃប្រសាទអំប្រ៊ីយ៉ុង ហើយធ្វើចំណាកស្រុកទៅកាន់ផ្នែក pharyngeal ដែលបង្កើតបានជារចនាសម្ព័ន្ធភាគច្រើននៃផ្ទៃមុខ។CNCC dysfunction ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុង etiology នៃ orofacial cleft ដែលជាការខុសប្រក្រតីពីកំណើត។ការផ្លាស់ប្តូរ Heterozygous SPECC1L ត្រូវបានគេរកឃើញនៅក្នុងអ្នកជំងឺដែលមានស្នាមឆែប atypical និង syndromic ។នៅទីនេះ យើងរាយការណ៍ពីការធ្វើឱ្យប្រឡាក់សារធាតុស្អិត Canonical adhesive junction (AJ) សមាសធាតុ β-catenin និង E-cadherin នៅក្នុងកោសិកាធ្លាក់ចុះ SPECC1L ដែលត្រូវបានដាំដុះ ហើយមីក្រូក្រាហ្វអេឡិចត្រុងបង្ហាញពីការសាយភាយ apical-basal នៃ AJ ។ដើម្បីយល់ពីតួនាទីរបស់ SPECC1L នៅក្នុង morphogenesis craniofacial យើងបានបង្កើតគំរូកណ្តុរដែលខ្វះខាត Specc1l ។Homozygous mutants គឺជាកោសិកាងាប់នៃអំប្រ៊ីយ៉ុង ហើយបង្ហាញពីការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទដែលខ្សោយ និងស្រទាប់ CNCC ។ស្នាមប្រឡាក់ប្រូតេអ៊ីន AJ ត្រូវបានកើនឡើងនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលផ្លាស់ប្តូរ។ពិការភាព AJ នេះគឺស្របជាមួយនឹងពិការភាពនៅក្នុង CNCC delamination ដែលទាមទារឱ្យមានការរំលាយ AJ ។លើសពីនេះទៀត Specc11 mutants បានកាត់បន្ថយសញ្ញា PI3K-AKT និងបង្កើន apoptosis ។នៅក្នុង vitro ការទប់ស្កាត់កម្រិតស្រាលនៃសញ្ញា PI3K-AKT នៅក្នុងកោសិកាប្រភេទព្រៃគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីជំរុញឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរ AJ ។សំខាន់ការផ្លាស់ប្តូរ AJ ដែលបណ្តាលមកពី SPECC1L knockdown អាចត្រូវបានបញ្ច្រាសដោយការធ្វើឱ្យសកម្មនៃផ្លូវ PI3K-AKT ។សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា SPECC1L ជានិយតករប្រលោមលោកនៃសញ្ញា PI3K-AKT និងជីវវិទ្យា AJ ត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ និងការដាក់កម្រិត CNCC ។
កោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial (CNCCs) ធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មទៅ neuroectoderm dorsal និងបំបែកចេញពី neuroepithelium នៃផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលកំពុងអភិវឌ្ឍតាមរយៈដំណើរការដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការផ្លាស់ប្តូរ epithelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3 ។Premigrating epithelial CNCCs រំខានដល់ប្រសព្វ intercellular និងក្លាយជាការផ្លាស់ប្តូរ mesenchymal CNCCs ដែលបំពេញ pharyngeal arches ទីមួយ និងទីពីរ និងបង្កើតជាឆ្អឹងខ្ចី craniofacial ភាគច្រើន។ដូច្នេះ ហ្សែនដែលគ្រប់គ្រងមុខងារ CNCC ជារឿយៗត្រូវបានរំខាននៅក្នុង etiology នៃភាពខុសប្រក្រតីពីកំណើតរបស់ craniofacial ដូចជា orofacial clefts ដែលភាគច្រើនប៉ះពាល់ដល់កំណើត 1/800 នៅសហរដ្ឋអាមេរិកតែម្នាក់ឯង។ពិការភាពពីកំណើត ៨.
ការបំបែកនៃ CNCC កើតឡើងស្របពេលជាមួយនឹងការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទខាងមុខចន្លោះពី 8.5 ទៅ 9.5 ថ្ងៃនៃការអភិវឌ្ឍន៍អំប្រ៊ីយ៉ុងនៅក្នុងសត្វកណ្តុរ។Mutants មួយចំនួននៃហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងការឆែបមាត់របស់កណ្តុរក៏បង្ហាញពីទម្រង់នៃពិការភាពនៃសរសៃប្រសាទផងដែរ រួមមាន Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, និង Pdgfrα12។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដំណើរការនៃការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ និងការធ្វើមាត្រដ្ឋាន CNCC អាចត្រូវបានចាត់ទុកថាឯករាជ្យ ព្រោះថា Splotch mutant mouse (Pax3) បង្ហាញពិការភាពក្នុងការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ ដោយមិនមានឥទ្ធិពលលើការធ្វើមាត្រដ្ឋាន CNCC ឬការចំណាកស្រុក 13,14 ។ម៉ូដែលកណ្តុរបន្ថែមដែលមានពិការភាពក្នុងការកាត់ CNCC និងការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទនឹងជួយកំណត់មូលដ្ឋានម៉ូលេគុលទូទៅនៃដំណើរការទាំងពីរនេះ។
ភាពឯកោនៃ CNCC ពីកោសិកា neuroepithelial តម្រូវឱ្យមានការរំលាយនៃ junctions adhesive (AJs) ដែលត្រូវបានផ្សំឡើងនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនដែលមាន, ក្នុងចំណោមរបស់ផ្សេងទៀត, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin និង α-actinin ដែលទាក់ទងនឹងសរសៃ actin 2 ការសិក្សាហួសប្រមាណ E-cadherin នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទបានបង្ហាញពីការថយចុះ ឬការពន្យាពេលក្នុងការ delamination CNCC ។ផ្ទុយទៅវិញ ការទប់ស្កាត់ E-cadherin នាំឱ្យមានការ stratification ដំណាក់កាលដំបូង 15,16 ។កត្តាជាច្រើនដែលសម្រុះសម្រួល EMT កំឡុងពេលធ្វើកម្រិត CNCC គឺជាកត្តាចម្លង (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) និងប្រូតេអ៊ីនកែច្នៃម៉ាទ្រីសក្រៅកោសិកា (ECM) ដូចជាម៉ាទ្រីស metalloproteinases (MMPs) ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ CNCCs គឺជា cytoskeletal AJ ដោយផ្ទាល់។ មិនទាន់ដឹងនៅឡើយ។ផ្លូវ PI3K-AKT ត្រូវបានគេស្គាល់ថាប្រឆាំងនឹងកម្រិត E-cadherin ជាចម្បងពីការស្រាវជ្រាវជំងឺមហារីក17។ការសិក្សាថ្មីៗបានបង្ហាញថាការបាត់បង់សញ្ញា PI3K-AKT ដែលមានមូលដ្ឋានលើ PDGFα នៅក្នុងសត្វកណ្តុរនាំឱ្យមានភាពមិនធម្មតានៃស្បែកក្បាល រួមទាំងក្រអូមមាត់ឆែប និងពិការភាពបំពង់សរសៃប្រសាទ 12 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយទំនាក់ទំនងរវាងផ្លូវ PI3K-AKT និងស្ថេរភាព AJ លើការធ្វើមាត្រដ្ឋាន CNCC គឺមិនច្បាស់លាស់ទេ។
ពីមុនយើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ SPECC1L ជាហ្សែនផ្លាស់ប្តូរដំបូងក្នុងមនុស្សពីរនាក់ដែលមានស្នាមឆែបធ្ងន់ធ្ងរដែលលាតសន្ធឹងពីមាត់ទៅភ្នែក ដែលគេស្គាល់ថាជា ឆែប oblique (ObFC) ឬ Tessier IV18 cleft ។ការផ្លាស់ប្តូរ SPECC1L ត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងគ្រួសារពហុជំនាន់ពីរដែលមានរោគសញ្ញា autosomal dominant Opitz G/BBB (OMIM #145410) ដែលក្នុងនោះបុគ្គលដែលរងផលប៉ះពាល់បានបង្ហាញពីជំងឺលើសឈាម និងបបូរមាត់ឆែប/ក្រអូមមាត់19 ហើយក្នុងគ្រួសារមួយដែលមានរោគសញ្ញា Tibi overdistance (OMIM #145420)20 .ជាងពាក់កណ្តាលនៃករណីនៃរោគសញ្ញា Opitz G/BBB គឺត្រូវបានភ្ជាប់ដោយ X (OMIM #300000) ហើយត្រូវបានបង្កឡើងដោយការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងហ្សែន MID1 ដែលបំប្លែងប្រូតេអ៊ីន 22 នៃគ្រោងកោសិកាដែលទាក់ទងនឹង microtubule ។យើងសន្មត់ថា SPECC1L ដែលជាប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង microtubules និង actin cytoskeleton អាចសម្របសម្រួលការបញ្ជូនសញ្ញាដែលតម្រូវសម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរ cytoskeleton actin កំឡុងពេលការស្អិតជាប់កោសិកា និងការធ្វើចំណាកស្រុក 18 ។តាមរយៈការសិក្សានៅក្នុង vitro និងនៅក្នុង vivo ឥឡូវនេះយើងពិពណ៌នាអំពី SPECC1L ថាជានិយតករប្រលោមលោកនៃស្ថេរភាព AJ តាមរយៈការផ្តល់សញ្ញា PI3K-AKT ។នៅកម្រិតកោសិកា កង្វះ SPECC1L បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃកម្រិតប្រូតេអ៊ីន pan-AKT និងការកើនឡើងនៃការបែកខ្ញែក apical-basal នៃ AJ ដែលត្រូវបានលុបចោលដោយការធ្វើឱ្យសកម្មគីមីនៃផ្លូវ AKT ។នៅក្នុង vivo អំប្រ៊ីយ៉ុងដែលខ្វះ Specc11 បង្ហាញពីការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទខ្សោយ និងកាត់បន្ថយការកាត់ CNCC ។ដូច្នេះ មុខងារ SPECC1L ក្នុង​ការ​ផ្តល់​សញ្ញា​ដែល​ផ្អែក​លើ​ការ​ស្អិត​របស់​កោសិកា​ដែល​មាន​ការ​គ្រប់គ្រង​ខ្ពស់​ដែល​ត្រូវ​ការ​សម្រាប់​មុខងារ CNCC ធម្មតា​ក្នុង​កំឡុង​ពេល​មាន​ទម្រង់​មុខ។
ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈតួនាទីរបស់ SPECC1L នៅកម្រិតកោសិកា យើងបានប្រើខ្សែកោសិកា osteosarcoma ដែលមានស្ថេរភាពដែលបានពិពណ៌នាពីមុន U2OS ខ្វះខាតនៅក្នុង SPECC1L18 ។កោសិកា U2OS ដែលមានស្ថេរភាពទាំងនេះជាមួយនឹង SPECC1L (kd) knockdown មានការថយចុះកម្រិតមធ្យម (60-70%) នៅក្នុងកម្រិតនៃប្រតិចារឹក និងប្រូតេអ៊ីន SPECC1L រួមជាមួយនឹងពិការភាពក្នុងការធ្វើចំណាកស្រុក និងការរៀបចំឡើងវិញនៃ actin cytoskeleton 18។ ផ្ទុយទៅវិញ ការថយចុះជាបណ្តោះអាសន្នធ្ងន់ធ្ងរនៅក្នុង SPECC1L ត្រូវបានបង្ហាញថានាំទៅរកពិការភាព mitotic 23 .នៅពេលកំណត់លក្ខណៈបន្ថែមទៀត យើងបានរកឃើញថាកោសិកា SPECC1L-kd ដែលមានស្ថេរភាពរបស់យើងបានផ្លាស់ប្តូរ morphology នៅកម្រិតខ្ពស់នៃការប្រសព្វគ្នា (រូបភាពទី 1) ។កោសិកាគ្រប់គ្រងបុគ្គល និងកោសិកា kd នៅចំនុចប្រសព្វទាបមើលទៅស្រដៀងគ្នា (រូបភាពទី 1A,D)។24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការលាយបញ្ចូលគ្នា កោសិកាគ្រប់គ្រងបានរក្សារូបរាងគូបរបស់វា (រូបភាព 1B, E) ខណៈពេលដែលកោសិកា SPECC1L-kd ពន្លូត (រូបភាព 1C, F)។វិសាលភាពនៃការផ្លាស់ប្តូរនេះនៅក្នុងរាងក្រឡាត្រូវបានថតដោយរូបភាពផ្ទាល់នៅក្នុង vivo នៃកោសិកាគ្រប់គ្រង និងកោសិកា kd (ភាពយន្ត 1)។ដើម្បីកំណត់តួនាទីរបស់ SPECC1L នៅក្នុងក្រឡាដែលជាប់គ្នា យើងបានពិនិត្យកន្សោមរបស់វាជាមុនសិន។យើងបានរកឃើញថាកម្រិតប្រូតេអ៊ីន SPECC1L បានកើនឡើងនៅពេលការលាយបញ្ចូលគ្នា (រូបភាព 1G) ចំណែកឯកម្រិតប្រតិចារិក SPECC1L មិនកើនឡើងទេ (រូបភាព 1H) ។លើសពីនេះ នៅពេលដែលដង់ស៊ីតេកោសិកាកើនឡើង ប្រូតេអ៊ីន SPECC1L បានប្រមូលផ្តុំនៅព្រំដែនអន្តរកោសិកា (រូបភាព 2A-E) ដោយមានលំនាំត្រួតលើគ្នាជាមួយនឹងសារធាតុ β-catenin ដែលភ្ជាប់ដោយភ្នាស (រូបភាព 2A'-E')។ដោយការផ្សារភ្ជាប់គ្នានៃ SPECC1L ជាមួយ actin cytoskeleton 18,23 យើងបានសន្មត់ថា SPECC1L ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ actin-based adhesive junctions (AJ) ។
(AF) កោសិកា SPECC1L knockdown (DF) ពង្រីកនៅចំនុចប្រសព្វខ្ពស់ (F) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកា U2OS (AC) ។បង្ហាញនៅទីនេះគឺជាចំណុចពេលវេលាបីក្នុងចំណោមប្រាំមួយ (T1, T3, T6) ដែលយើងជ្រើសរើសសម្រាប់ដង់ស៊ីតេកោសិកាផ្សេងៗគ្នា។(G) ការវិភាគបស្ចិមប្រទេសដែលបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីន SPECC1L មានស្ថេរភាពនៅកម្រិតខ្ពស់នៃការប្រសព្វធៀបនឹងកម្រិតទាបនៃចំណុចប្រសព្វនៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង។ប្លុកខាងលិចនៃ SPECC1L បង្ហាញពីក្រុមតន្រ្តី 120 kDa ដែលរំពឹងទុក និងក្រុមទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ជាង ដែលអាចកែប្រែក្រោយការបកប្រែ (*)។ការវិភាគប្លុកលោកខាងលិចត្រូវបានអនុវត្តក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នាសម្រាប់ការប្រសព្វគ្នាទាបនិងខ្ពស់។រូបភាពដែលបង្ហាញ SPECC1L នៅចំនុចប្រសព្វទាប និងខ្ពស់ ត្រូវបានយកចេញពីប្លុកដូចគ្នា។ដុំពកដូចគ្នាត្រូវបានដកចេញ និងពិនិត្យម្តងទៀតជាមួយនឹងអង់ទីករ β-actin ។(H) ការវិភាគបរិមាណ RT-PCR បានបង្ហាញថាមិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងកម្រិតប្រតិចារិក SPECC1L ទេ។របារកំហុសតំណាងឱ្យ SEMs ពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបួន។
(AE) យើងបានជ្រើសរើសចំណុចពេលវេលាចំនួនប្រាំមួយ (T1-T6) ដែលតំណាងឱ្យជួរនៃដង់ស៊ីតេកោសិកាដើម្បីធ្វើការវិភាគរូបរាងកោសិកាធម្មតា និងការផ្លាស់ប្តូរ AJ នៅក្នុងកោសិកា U2OS ជាមួយនឹង SPECC1L knockdown (kd)។ចំណុចទាំងប្រាំដំបូងនៃពេលវេលាទាំងនេះរួមមានកោសិកាតែមួយ (T1) 50-70% ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃចង្កោមកោសិកាតូចៗ (T2) ការលាយបញ្ចូលគ្នាដោយមិនផ្លាស់ប្តូរទ្រង់ទ្រាយកោសិកា kd (T3) ការបង្កើតកោសិកា kd ឡើងវិញ (T4) និងការផ្លាស់ប្តូរ 24 ម៉ោង។ក្នុងទម្រង់ក្រោយនៃកោសិកា kd (T5) ។ប្រូតេអ៊ីន SPECC1L ត្រូវបានបែកខ្ញែកជាចម្បងនៅក្នុង cytoplasm នៅ T1 (A) ប៉ុន្តែការប្រមូលផ្តុំរបស់វាត្រូវបានសង្កេតឃើញនៅព្រំដែនអន្តរកោសិកានៅចំណុចពេលវេលាជាបន្តបន្ទាប់ (B-E, ព្រួញ)។(FJ) β-catenin បង្ហាញពីការប្រមូលផ្តុំស្រដៀងគ្នានៅព្រំដែនអន្តរកោសិកាដែលទាក់ទងនឹងស្មុគស្មាញ AJ ។(A'-E') SPECC1L និង β-catenin បង្ហាញស្នាមប្រឡាក់ត្រួតគ្នានៅព្រំដែនកោសិកានៅដង់ស៊ីតេកោសិកាខ្ពស់ (ព្រួញ)។(F'-J') នៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd ស្នាមប្រឡាក់ β-catenin លេចឡើងជាធម្មតានៅដង់ស៊ីតេកោសិកាទាប (F'-H') ប៉ុន្តែពង្រីកនៅពេលដែលកោសិកាផ្លាស់ប្តូរ (I', J'; ព្រួញ) ដែលបង្ហាញថា AJ បានផ្លាស់ប្តូរ។របារ = 10 µm ។
បន្ទាប់មក យើងបានព្យាយាមកំណត់ឥទ្ធិពលនៃកង្វះ SPECC1L លើ AJ។យើងបានប្រើសញ្ញាសម្គាល់ដែលពាក់ព័ន្ធ AJ ជាច្រើន រួមទាំងសមាសធាតុ Canonical F-actin, myosin IIb, β-catenin និង E-cadherin24,25,26,27។សរសៃស្ត្រេស Actin បានកើនឡើងនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (រូបភាព 3A,B) 18 ។Myosin IIb ដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងសរសៃ actin បានបង្ហាញពីការកើនឡើងស្រដៀងគ្នានៃកោសិកា SPECC1L-kd នៅក្នុង vitro (រូបភាព 3C,D) ។β-catenin ដែលពាក់ព័ន្ធ AJ ភ្ជាប់ទៅនឹង cadherin នៅភ្នាសកោសិកា ដោយបង្ហាញគំរូកន្សោម "honeycomb" ធម្មតានៅក្នុងគូបគ្រប់គ្រង (រូបភាព 3E, G) ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍នៅក្នុងរូបភាពសំប៉ែតដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍បង្រួបបង្រួម β-catenin (រូបភាព 3E, F) និង E-cadherin (រូបភាព 3G, H) ស្នាមប្រឡាក់នៅលើភ្នាសកោសិកានៃកោសិកាដែលខ្វះ SPECC1L ដែលជាប់គ្នាបានបង្ហាញពីគំរូលេចធ្លោនៃស្នាមប្រឡាក់បន្តបន្ទាប់។ការពង្រីកនៃស្នាមប្រឡាក់ β-catenin ដែលពាក់ព័ន្ធ AJ នៅក្នុងកោសិកា kd ត្រូវបានគេដឹងច្បាស់បំផុតនៅចំនុចប្រសព្វ ប៉ុន្តែបានលេចឡើងមុនការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (រូបភាព 2F-J, F'-J')។ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈរូបវន្តនៃស្នាមប្រឡាក់ AJ ដែលបានពង្រីកនេះ យើងបានពិនិត្យព្រំដែនកោសិកានៅលើផ្ទៃ apical-basal នៃកោសិកា SPECC1L-kd U2OS ដោយការបញ្ជូនមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុង (TEM) (រូបភាព 3I,J) ។ផ្ទុយទៅនឹងកោសិកាគ្រប់គ្រង (រូបទី 3I) ដែលមានតំបន់ក្រាស់អេឡិចត្រុងដាច់ដោយឡែកដែលចង្អុលបង្ហាញពី AJ (ព្រួញ) កោសិកា kd (រូបភាព 3J) បានបង្ហាញតំបន់ជាប់គ្នាដ៏ធំនៃដង់ស៊ីតេអេឡិចត្រុងខ្ពស់ដែលបង្ហាញពី AJ តាមបណ្តោយយន្តហោះ apicobasal ។.លើសពីនេះ នៅលើផ្នែកឆ្លងកាត់ យើងសង្កេតឃើញមានផ្នត់ភ្នាសកោសិកាយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងកោសិកា kd (រូបភាព S1A,B) ដែលពន្យល់ពីគំរូពង្រីកនៃ β-catenin និង E-cadherin ស្នាមប្រឡាក់ (រូបភាព 3F, H)។ក្នុងការគាំទ្រតួនាទីរបស់ SPECC1L ក្នុង AJs β-catenin ត្រូវបាន co-immunoprecipitated ជាមួយ SPECC1L ក្នុង lysates នៃកោសិកា U2OS ដែលជាប់គ្នា (រូបភាព 3K) ។រួមជាមួយនឹងការពង្រីកភាពស៊ាំសម្រាប់សញ្ញាសម្គាល់ AJ ការវិភាគ TEM គឺស្របនឹងសម្មតិកម្មរបស់យើងដែលថាកង្វះ SPECC1L បង្កើនដង់ស៊ីតេ AJ apical-basal និងភាពខុសប្លែកគ្នា។
(AH) ការកើនឡើងនៃស្នាមប្រឡាក់ F-actin នៅក្នុងកោសិកា kd នៅ 48 ម៉ោងក្រោយការលាយបញ្ចូលគ្នា (T6; A, B) ។ការផ្លាស់ប្តូរស្នាមប្រឡាក់នៃ myosin IIb ដែលទាក់ទងនឹង F-actin (C, D) ។លំនាំរលោងនៃស្នាមប្រឡាក់ភ្នាស β-catenin និង E-cadherin នៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង (E, G) ត្រូវបានពង្រឹងនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd (F, H) ។របារ = 10 µm ។(I–J) មីក្រូក្រាហ្វអេឡិចត្រុងដែលសង្កេតមើលប្រសព្វអន្តរកោសិកា apical-basal ។ក្រឡាវត្ថុបញ្ជាបង្ហាញតំបន់ក្រាស់អេឡិចត្រុងដាច់ដោយឡែកដែលបង្ហាញពីប្រសព្វស្អិត (I, ព្រួញ)។ផ្ទុយទៅវិញ ប្រសព្វ apical-basal ទាំងមូលនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd លេចចេញជាអេឡិចត្រុងក្រាស់ (J, ព្រួញ) ដែលបង្ហាញពីដង់ស៊ីតេកើនឡើង និងការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយនៃប្រសព្វ adhesive ។(K) β-catenin ត្រូវបាន co-immunoprecipitated ជាមួយ SPECC1L ក្នុង lysates កោសិកា U2OS ជាប់គ្នា។រូបភាព​ថត​ពី​កន្លែង​មួយ​តំណាង​ឱ្យ​ការ​ពិសោធន៍​ឯករាជ្យ​មួយ​ក្នុង​ចំណោម​បួន។
ដើម្បីយល់ពីតួនាទីរបស់ SPECC1L នៅក្នុង morphogenesis craniofacial យើងបានបង្កើតគំរូកណ្តុរដែលខ្វះខាត Specc1l ដោយប្រើខ្សែកោសិកាអន្ទាក់ ES ឯករាជ្យពីរគឺ DTM096 និង RRH048 (BayGenomics, CA) ដែលតំណាងឱ្យ intron 1 និង Specc1l ប្រតិចារឹកត្រូវបានចាប់យកនៅ 15 (រូបភាព 1) .4A រូប S2)។ទីតាំងហ្សែននៃការបញ្ចូលវ៉ិចទ័រ decoy ត្រូវបានកំណត់ដោយលំដាប់ហ្សែនទាំងមូល និងបញ្ជាក់ដោយ PCR (រូបភាព S2) ។ការរចនាអន្ទាក់ហ្សែនទាំងពីរក៏អនុញ្ញាតឱ្យមានការលាយបញ្ចូលគ្នាក្នុងស៊ុមនៃអ្នកយកព័ត៌មាន Specc11-lacZ នៅពេលចាប់យក។ដូច្នេះកន្សោម lacZ កំណត់ដោយស្នាមប្រឡាក់ X-gal ត្រូវបានប្រើជាសូចនាករនៃការបញ្ចេញមតិ Specc11 ។អាឡែសទាំងពីរបានបង្ហាញពីគំរូកន្សោម lacZ ស្រដៀងគ្នា ជាមួយនឹងអន្ទាក់ហ្សែន DTM096 នៅក្នុង intron 1 បង្ហាញពីកន្សោមខ្លាំងជាង RRH048 នៅក្នុង intron 15 (មិនបានបង្ហាញ) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ Specc1l ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងទូលំទូលាយ ជាមួយនឹងការបញ្ចេញមតិខ្លាំងជាពិសេសនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទនៅ E8.5 (រូបភាព 4B) នៅក្នុងបំពង់សរសៃប្រសាទ និងដំណើរការផ្ទៃមុខនៅ E9.5 និង E10.5 (រូបភាព 4C, D) និងក្នុងការអភិវឌ្ឍអវយវៈ។ នៅ E10 ។5 និងភ្នែក (រូបភាព 4D) ។យើងបានរាយការណ៍ពីមុនថាកន្សោម SPECC1L នៅក្នុងផ្ចិត pharyngeal ដំបូងនៅ E10.5 មានវត្តមាននៅក្នុង epithelium និង mesenchyme18 ក្រោមដែលស្របជាមួយនឹងខ្សែស្រឡាយ CNCC ។ដើម្បីសាកល្បងកន្សោម SPECC1L នៅក្នុង CNCC យើងបានអនុវត្តផ្នត់សរសៃប្រសាទ E8.5 (រូបភាព 4E-J) និងផ្នែកលលាដ៍ក្បាល E9.5 (រូបភាព 4K-)។នៅ E8.5, SPECC1L បានប្រឡាក់ប្រឡាក់ប្រសាទយ៉ាងខ្លាំងក្លា (រូបភាព 4E, H) រួមទាំងកោសិកាដែលមានស្នាមប្រឡាក់ជាមួយសញ្ញាសម្គាល់ NCC (រូបភាព 4G, J)។នៅ E9.5, SPECC1L (Fig ។ 4K, N) បានប្រឡាក់យ៉ាងខ្លាំងការធ្វើចំណាកស្រុក CNCC ដែលមានស្នាមប្រឡាក់ជាមួយ AP2A (រូបភាព 4L, M) ឬ SOX10 (រូបភាព 4O, P) ។
(ក) ការតំណាងតាមគ្រោងការណ៍នៃហ្សែន Specc11 របស់កណ្តុរដែលបង្ហាញពីការបញ្ចូលវ៉ិចទ័រ decoy នៅក្នុង ES DTM096 (intron 1) និង RRH048 (intron 15) កោសិកាក្លូន។(BD) lacZ staining នៃ heterozygous Specc1lDTM096 embryos តំណាងឱ្យ Specc1l expression ពី E8.5 ដល់ E10.5 ។NE = neuroectoderm, NF = ផ្នត់សរសៃប្រសាទ, PA1 = ក្លោងទ្វារ pharyngeal ដំបូង។(EP) ការចាក់ថ្នាំបង្ការរោគ SPECC1L ជាមួយនឹងសញ្ញាសម្គាល់ NCC AP2A និង SOX10 នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ E8.5 (NF; EJ) និងផ្នែកលលាដ៍ក្បាល E9.5 (KP) ។ស្នាមប្រឡាក់ SPECC1L ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ E8.5 (E, H; ក្បាលព្រួញ) រួមទាំងកោសិកាដែលមានស្លាក AP2A (F, G; ក្បាលព្រួញ) និង SOX10 (I, J; ក្បាលព្រួញ)។នៅ E9.5, SPECC1L បានប្រឡាក់យ៉ាងខ្លាំងចំពោះការធ្វើចំណាកស្រុក CNCCs (K, N; ព្រួញ) ដែលមានស្លាក AP2A (L, M; ព្រួញ) និង SOX10 (O, P; ព្រួញ)។
ការឆ្លងកាត់រវាងសត្វកណ្ដុរប្រភេទ Heterozygous Specc1lDTM096/+ និង Specc1lRRH048/+ បង្ហាញថា ហ្សែនអន្ទាក់ហ្សែនទាំងពីរមិនត្រូវបានបំពេញបន្ថែមទេ ហើយសមាសធាតុ heterozygotes និង homozygotes អំប្រ៊ីយ៉ុងសម្រាប់ហ្សែនអន្ទាក់អាឡែរទាំងពីរគឺជាអ្នកស្លាប់ដោយអំប្រ៊ីយ៉ុង (តារាង S1) ។សមាមាត្រ Mendelian បានបង្ហាញពីការថយចុះនៃអត្រារស់រានមានជីវិតរបស់ heterozygotes នៅពេលកើត (រំពឹងទុក 1.34 ទល់នឹង 2.0) ។យើងបានកត់សម្គាល់ឃើញថាមានអត្រាមរណៈទាបក្នុងចំនោម heterozygotes ខ្លះមានភាពមិនប្រក្រតីនៃខួរក្បាល (រូបភាព S3)។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការជ្រៀតចូលទាបនៃ phenotypes craniofacial perinatal ទាំងនេះធ្វើឱ្យមានការលំបាកក្នុងការសិក្សាពីយន្តការនៃរោគសរីរវិទ្យាមូលដ្ឋានរបស់វា។ដូច្នេះហើយ យើងបានផ្តោតទៅលើ phenotype ដ៍សាហាវនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងនៃពពួកពពួក Specc11 mutants homozygous ។
សមាសធាតុផ្សំភាគច្រើន heterozygous ឬ homozygous Specc1lDTM096/RRH048 អំប្រ៊ីយ៉ុង mutant មិនវិវឌ្ឍន៍បន្ទាប់ពី E9.5–10.5 (រូបភាព 5A–D) ហើយបំពង់សរសៃប្រសាទមិនបិទផ្នែកខាងមុខទេ (រូបភាព 5B, D) ហើយជួនកាលបិទនៅខាងក្រោយ (មិនបានបង្ហាញ) ..ពិការភាពនៃការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ cranial នេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង CNCC ភាគច្រើនសម្គាល់ DLX2 ដែលនៅសេសសល់ក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទនៅ E10.5 ដែលបង្ហាញថាគ្មានការកាត់ចេញទេ (រូបភាព 5A'-D') ។ដើម្បីកំណត់ថាតើទំហំទាំងមូលរបស់ CNCC ត្រូវបានកាត់បន្ថយផងដែរ យើងបានដាក់ស្លាកបន្ទាត់ CNCC ជាមួយ GFP នៅក្នុងបន្ទាត់អន្ទាក់ហ្សែនរបស់យើងជាមួយនឹង Wnt1-Cre និង ROSAmTmG ។យើងស្ទ្រីមបានតម្រៀប GFP+ NCC និង GFP- (RFP+) មិនមែន NCC ពីអំប្រ៊ីយ៉ុងទាំងមូល។នៅ E9.5 សមាមាត្រនៃលំហូរ-តម្រៀប CNCCs ដែលមានស្លាក GFP មិនបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំងរវាង WT និងអំប្រ៊ីយ៉ុង mutant (មិនបានបង្ហាញ) ដែលបង្ហាញពីការបញ្ជាក់របស់ CNCC ធម្មតា។ដូច្នេះហើយ យើងបានសន្មត់ថា សំណល់ Wnt1-Cre និង DLX2 ស្នាមប្រឡាក់នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលលាតត្រដាង (រូបភាព 5B') គឺដោយសារតែស្រទាប់ CNCC ដែលខូច ប្រហែលជាដោយសារតែការកើនឡើងនៃដង់ស៊ីតេ ឬការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយនៃកោសិកា AJ ដូចដែលបានឃើញនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd ។យើងបានប្រើសញ្ញាសម្គាល់ NCC SOX10, AP2A, និង DLX2 ដើម្បីបញ្ជាក់ពីវត្តមានរបស់ CNCC នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ (រូបភាព 5E-R)។នៅ E8.5 ស្នាមប្រឡាក់សរសៃប្រសាទសម្រាប់សញ្ញាសម្គាល់ NCC ទាំងបីត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងផ្នែកនៃ WT (រូបភាព 5E, G, I) និង Specc1l mutant (រូបភាព 5F, H, J) ។នៅ E9.5 ខណៈពេលដែលសញ្ញាសម្គាល់ NCC ប្រឡាក់ NCC ចំណាកស្រុកនៅក្នុងផ្នែក WT (រូបភាព 5M, O, Q) ស្នាមប្រឡាក់ NCC ដែលនៅសល់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលលាតត្រដាងនៃ Specc1l mutant embryos (រូបភាព 5N, P, R) ។ដោយសារតែ SOX10 និង DLX2 សម្គាល់ការធ្វើចំណាកស្រុក CNCCs លទ្ធផលនេះបង្ហាញថា CNCCs ខ្វះ SPECC1L សម្រេចបាននូវការបញ្ជាក់ក្រោយការធ្វើចំណាកស្រុក ប៉ុន្តែបរាជ័យក្នុងការធ្វើចំណាកស្រុកពីផ្នត់សរសៃប្រសាទ។
កង្វះ Specc11 នាំឱ្យមានការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទដែលមានបញ្ហា ការបំផ្លាញកោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial និង AJs ។
(A, B') E9.5 WT (A) អំប្រ៊ីយ៉ុងផ្ទុកកោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial cranial (CNCC) ដែលមានស្លាក Wnt1-Cre (A') ។ផ្ទុយទៅវិញ អំប្រ៊ីយ៉ុងបំប្លែង Specc11 បង្ហាញពីផ្នត់សរសៃប្រសាទបើកចំហ (B) ក្បាលព្រួញ) និង CNCCs ដែលមិនបានធ្វើចំណាកស្រុក (B', ក្បាលព្រួញ)។(C, D') រូបភាពវាលភ្លឺ (C, D') និង immunostaining (C', D') នៃសញ្ញាសម្គាល់ CNCC DLX2 នៃអំប្រ៊ីយ៉ុង E10.5 WT (C, C') និង Specc1l (D, D') ។នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុង WT E10.5, DLX2-positive CNCC ធ្វើអាណានិគមលើក្លោងទ្វារអញ្ចាញធ្មេញ (C', ព្រួញ) ខណៈពេលដែលនៅក្នុង mutants ស្នាមប្រឡាក់ជាក់ស្តែងនៅតែមាននៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទចំហ (D', ព្រួញ) និងនៅក្នុងផ្នត់ pharyngeal ដំបូង (D', ព្រួញ) ។) ជាមួយនឹងស្នាមប្រឡាក់មួយចំនួន (ព្រួញ) ដែលបង្ហាញពីការខូចទ្រង់ទ្រាយ និងការធ្វើចំណាកស្រុករបស់ CNCC មិនល្អ។ER) ផ្នែកនៃ WT និង Specc1l អំប្រ៊ីយ៉ុង mutant នៅដំណាក់កាល E8.5 (E–L) និង E9.5 (M–R) ត្រូវបានដាក់ស្លាកដោយសញ្ញាសម្គាល់ NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) និង DLX2 (I, J, Q, R) ។នៅ E8.5 ស្នាមប្រឡាក់ NCC ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទប្រភេទព្រៃ (NF) និងផ្នែកដែលផ្លាស់ប្តូរ។ស្នាមប្រឡាក់រួមគ្នានៃ SOX10 និង β-catenin នៅក្នុង E8.5 WT (K) និង mutant (L) បានបង្ហាញឱ្យឃើញការកើនឡើងនៃស្នាមប្រឡាក់ β-catenin នៅព្រំដែនកោសិកានៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ។នៅ E9.5 ស្នាមប្រឡាក់ប្រភេទព្រៃនៃការធ្វើចំណាកស្រុក CNCCs (M, O, Q) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ ខណៈពេលដែលនៅក្នុង mutants, CNCCs unstratified បានប្រឡាក់ផ្នត់សរសៃប្រសាទបើកចំហ (N, P, R) ។(S–Z) ការវិភាគស្លាកសញ្ញា vivo AJ នៅក្នុងផ្នែក coronal នៃអំប្រ៊ីយ៉ុង WT និង Specc11DTM096/RRH048 ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរ E9.5 ។ប្លង់ផ្នែកប្រហាក់ប្រហែលត្រូវបានបង្ហាញនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងលើ។នៅក្នុងផ្នែកនៃជាលិកាផ្លាស់ប្តូរការកើនឡើងនៃស្នាមប្រឡាក់ F-actin (S, T) និង myosin IIb (U, V) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ។ស្រដៀងគ្នាទៅនឹងលទ្ធផល in vitro នៅក្នុងរូបភាពទី 3 នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុងដែលផ្លាស់ប្តូរ ការធ្វើឱ្យប្រឡាក់ភ្នាសសម្រាប់ β-catenin (W, X) និង E-cadherin (Y, Z) ត្រូវបានអង្កេត។(AA-BB) មីក្រូក្រាហ្វអេឡិចត្រុងនៃផ្នែកមួយនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងប្រភេទព្រៃដែលមើលទៅហួសព្រំដែននៃកោសិកា apical-basal បង្ហាញតំបន់ក្រាស់អេឡិចត្រុងដាច់ដោយឡែកដែលបង្ហាញពីចំណុចប្រសព្វស្អិត (AA, ព្រួញ)។ផ្ទុយទៅវិញ នៅក្នុងផ្នែកនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងបំប្លែង Specc11 (BB, ព្រួញ) ប្រសព្វ apicobasal ទាំងមូលគឺក្រាស់អេឡិចត្រុង ដែលបង្ហាញពីដង់ស៊ីតេកើនឡើង និងការបែកខ្ញែកនៃប្រសព្វ adhesive ។
ដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មរបស់យើងថាការកាត់បន្ថយស្រទាប់គឺដោយសារតែការផ្លាស់ប្តូរ AJ យើងបានពិនិត្យមើលការដាក់ស្លាក AJ នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលបានលាតត្រដាងនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងបំប្លែង Specc1l (រូបភាព 5S-Z) ។យើងបានសង្កេតឃើញការកើនឡើងនៃសរសៃស្ត្រេស actin (រូបភាព 5S, T) និងការបង្កើនការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃស្នាមប្រឡាក់ myosin IIB នៅលើសរសៃ actin (រូបភាព 5U, V) ។សំខាន់ យើងសង្កេតឃើញការកើនឡើងនូវស្នាមប្រឡាក់នៃ β-catenin (រូបភាព 5W, X) និង E-cadherin (រូបភាព 5Y, Z) នៅព្រំដែនរវាងកោសិកា។យើងក៏បានពិនិត្យមើលស្នាមប្រឡាក់ β-catenin នៃ NCC នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទនៃអំប្រ៊ីយ៉ុង E8.5 (រូបភាព 5K, L)។ស្នាមប្រឡាក់ β-catenin ហាក់ដូចជាកាន់តែខ្លាំងនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទរបស់ Specc1l (រូបភាព 5L និង K) ដែលបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរ AJ បានចាប់ផ្តើម។នៅក្នុងមីក្រូក្រាហ្វអេឡិចត្រុងនៃផ្នែកលលាដ៍ក្បាលនៃអំប្រ៊ីយ៉ុង E9.5 យើងសង្កេតឃើញម្តងទៀតនូវការកើនឡើងនៃស្នាមប្រឡាក់អេឡិចត្រុងក្រាស់នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុង Specc1l mutant បើប្រៀបធៀបទៅនឹង WT (រូបភាព 5AA, BB និង S1E-H)។សរុបមក លទ្ធផលទាំងនេះគាំទ្រលទ្ធផល in vitro របស់យើងនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd U2OS ហើយណែនាំថាស្នាមប្រឡាក់ AJ ដែលមិនប្រក្រតីនាំមុខ CNCC stratification នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុង mutant របស់យើង។
ដោយសារទំនាក់ទំនងប្រឆាំងដែលគេស្គាល់រវាងសកម្មភាព AKT ​​និងស្ថេរភាព E-cadherin, 17,28 យើងបានសន្មត់ថាការចូលរួមនៃសញ្ញា PI3K-AKT ។លើសពីនេះទៀត យើងបានសង្កេតឃើញពងបែក subepidermal នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុង mutant មួយចំនួនរបស់យើងដែលបានរួចផុតពីភាពស្លាប់ (<5%) នៅ E9.5-10.5 ហើយជំនួសមកវិញនៅប្រហែល E13.5 (រូបភាព S3)។សរសៃឈាមតូចៗគឺជាសញ្ញាសម្គាល់នៃការថយចុះនៃសញ្ញា PI3K-AKT ដោយផ្អែកលើ PDGFRα12 ។Fantauzzo et al ។(2014) បានរាយការណ៍ថាការរំខាននៃការធ្វើឱ្យសកម្ម PI3K ដែលមានមូលដ្ឋានលើ PDGFRα នៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុងបំប្លែង PdgfraPI3K/PI3K បណ្តាលឱ្យមាន vesicles subepidermal, ពិការភាពបំពង់សរសៃប្រសាទ និង phenotypes ក្រអូមមាត់ឆែប។ជាការពិតណាស់ កម្រិតនៃ pan-AKT និង phosphorylated Ser473-AKT សកម្មត្រូវបានកាត់បន្ថយនៅក្នុង vivo នៅក្នុងជាលិកា mutant Specc1l ទៅជា E9.5 ការចាប់អំប្រ៊ីយ៉ុង (រូបភាព 6A-D) ។ការថយចុះនៃកម្រិត phosphorylated Ser473-AKT អាចកើតឡើងទាំងស្រុងដោយសារតែការថយចុះនៃកម្រិត pan-AKT នៅក្នុង vivo (រូបភាព 6E) និង in vitro (រូបភាព 6F) ។ការថយចុះនៅក្នុង vitro ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញតែនៅពេលដែលកោសិកា U2OS មានភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាយ៉ាងខ្លាំងជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា និងដង់ស៊ីតេ AJ (រូបភាព 6D) ។ដូច្នេះទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថា SPECC1L គឺជានិយតករវិជ្ជមានថ្មីនៃសញ្ញា PI3K-AKT នៅក្នុង morphogenesis craniofacial ។
(A–E) E8.5 (A,B) និង E9.5 (C,D) ផ្នែកលលាដ៍ក្បាល ឬ E9.5 lysates ពី Specc1l mutant embryos (E) បង្ហាញពីកម្រិតនៃសារធាតុសកម្ម phosphorylated S473-AKT និង pan-AKT កាត់បន្ថយប្រូតេអ៊ីន បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការគ្រប់គ្រង WT ។ការលាបពណ៌លោកខាងលិចត្រូវបានអនុវត្តលើ lysates ប្រភេទព្រៃ និង lysates mutant នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា។រូបភាពដែលបង្ហាញសម្រាប់ SPECC1L ត្រូវបានយកចេញពីប្លុកមួយ។ដុំពកដូចគ្នាត្រូវបានដកចេញ និងពិនិត្យម្តងទៀតជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង pan-ACT និង β-actin ។កម្រិត Pan-AKT នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ E8.5 (A, B) និងកម្រិតនៃ phosphorylated S473-AKT នៅក្នុងផ្នែកលលាដ៍ក្បាល E9.5 ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង។(F) កម្រិត Pan-AKT ត្រូវបានកាត់បន្ថយស្រដៀងគ្នានៅក្នុង lysates នៃកោសិកា SPECC1L-kd U2OS ដែលប្រមូលផលនៅចំនុចប្រសព្វខ្ពស់។របារកំហុសតំណាងឱ្យ SEMs ពីបរិមាណ blot លោកខាងលិចឯករាជ្យចំនួនបី។(GJ) ផ្នែកនៃអំប្រ៊ីយ៉ុង WT នៅ E9.5 ប្រឡាក់ដោយ KI67 និង cleaved caspase 3 រៀងគ្នា ដែលបង្ហាញពីការរីកសាយកោសិកា (G, G') និងសកម្មភាព apoptotic តិចតួច (H, H') ។Specc11 mutant embryos បង្ហាញពីការរីកសាយកោសិកាដែលអាចប្រៀបធៀបបាន (I) ប៉ុន្តែចំនួនកោសិកាដែលឆ្លងកាត់ការ apoptosis គឺកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំង (J)។
បន្ទាប់មកយើងបានពិនិត្យសញ្ញាសម្គាល់នៃការរីកសាយ និង apoptosis ។យើងមិនបានសង្កេតឃើញភាពខុសគ្នាណាមួយនៃការរីកសាយនៃអំប្រ៊ីយ៉ុង E9.5 (រូបភាព 6E, G ធៀបនឹង I) ជាមួយនឹងសន្ទស្សន៍ការរីកសាយ 82.5% សម្រាប់ WT mutants និង 86.5% សម្រាប់ពពួក Specc1l mutants ដែលវាស់វែងដោយស្នាមប្រឡាក់ KI67 (ទំ <0.56, Fisher's ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដ) ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ យើងមិនបានសង្កេតឃើញភាពខុសគ្នាណាមួយនៅក្នុង apoptosis ដែលវាស់វែងដោយស្នាមប្រឡាក់សម្រាប់ cleaved caspase 3 នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទនៅ E8.5 រហូតដល់ការចាប់អំប្រ៊ីយ៉ុង (មិនបង្ហាញ) (មិនបង្ហាញ) ។ផ្ទុយទៅវិញ ការ apoptosis ត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងអំប្រ៊ីយ៉ុងដែលផ្លាស់ប្តូរ E9.5 ទាំងអស់ (រូបភាព 6F, H និង J)។ការកើនឡើងជាទូទៅនៃ apoptosis គឺស្របជាមួយនឹងការថយចុះនៃសញ្ញា PI3K-AKT និងភាពងាប់នៃអំប្រ៊ីយ៉ុងដំបូង 29,30,31។
បន្ទាប់មក ដើម្បីបញ្ជាក់ពីតួនាទីមូលហេតុសម្រាប់ការផ្តល់សញ្ញា PI3K-AKT នៅក្នុងការផ្លាស់ប្តូរ AJ នៅក្នុងកោសិកា kd របស់យើង យើងបានផ្លាស់ប្តូរផ្លូវគីមីនៅក្នុងការគ្រប់គ្រង និងកោសិកា kd (រូបភាព 7A-F) ។យើងបានប្រើជាសញ្ញាសម្គាល់នៃការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកាដែលបានសង្កេតឃើញនៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd ជាប់គ្នា ដែលយើងកំណត់បរិមាណដោយប្រើសមាមាត្រនៃវិមាត្រវែងបំផុត (ប្រវែង) ទៅវិមាត្របញ្ឈរដែលត្រូវគ្នា (ទទឹង)។សមាមាត្រនៃ 1 ត្រូវបានរំពឹងទុកសម្រាប់កោសិការាងមូល ឬគូប (រូបភាព 7G) ។បន្ថែមពីលើរូបរាងកោសិកា យើងក៏បានបញ្ជាក់ពីឥទ្ធិពលលើ AJ ដោយស្នាមប្រឡាក់ β-catenin (រូបភាព 7A'-F')។ការរារាំងផ្លូវ PI3K-AKT ដោយប្រើ wortmannin គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកានៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង (រូបភាព 7A, C) និង AJ (រូបភាព 7A') ។PI3K-AKT activator SC-79 មិនប៉ះពាល់ដល់រូបរាងកោសិកា (រូបភព 7A, E) ឬការពង្រីក AJ (Fig ។ 7A') នៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង។នៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd ការបង្ក្រាបបន្ថែមទៀតនៃផ្លូវ PI3K-AKT បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនៃ apoptosis (រូបភាព 7B,D) និងការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃស្នាមប្រឡាក់ β-catenin (រូបភាព 7B') ដែលស្របជាមួយនឹងសារធាតុ mutants ធ្ងន់នៅក្នុង vivo របស់យើង។សំខាន់ ការធ្វើឱ្យសកម្មនៃផ្លូវ PI3K-AKT ធ្វើឱ្យរូបរាងកោសិកាប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំង (រូបភាព 7B, F) និង AJ phenotypes (រូបភាព 7B") ។ការផ្លាស់ប្តូររាងក្រឡាត្រូវបានគេកំណត់បរិមាណជាសមាមាត្រជុំក្រឡា (CCR) ហើយប្រៀបធៀបសម្រាប់សារៈសំខាន់ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ (រូបភាព 7G)។ជាការពិតនៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រង (រូបភាព 7G, CCR = 1.56) ការព្យាបាលដោយប្រើ wortmannin គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកាយ៉ាងសំខាន់ (រូបភាព 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) ក្នុងកម្រិតដែលស្រដៀងនឹងអ្វីដែលបានសង្កេតឃើញ។ ក្នុង SPECC1L ។-kd ក្រឡា (រូបភាព 7G, CCR = 3.46) ។ការព្យាបាល Wortmannin នៃកោសិកា SPECC1L-kd (រូបភាព 7G, CCR = 3.60, ធ្វេសប្រហែស) មិនសំខាន់ជាងកោសិកា kd ដែលមិនបានព្យាបាលទេ (រូបភាព 7G, CCR = 3.46, ធ្វេសប្រហែស) ឬកោសិកាគ្រប់គ្រងដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ wortmannin (រូបភាព 7G) ។, CCR = 3.46, ធ្វេសប្រហែស) លើសពីនេះទៀតប៉ះពាល់ដល់ការពន្លូតកោសិកា (7G, CCR = 3.61, ធ្វេសប្រហែស) ។អ្វីដែលសំខាន់បំផុតនោះ SC-79 activator AKT បានស្ដារឡើងវិញនូវ phenotype ពន្លូតនៃកោសិកា SPECC1L-kd (រូបភាព 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12)។លទ្ធផលទាំងនេះបញ្ជាក់ថា SPECC1L ធ្វើនិយ័តកម្មសញ្ញា PI3K-AKT ហើយណែនាំថាការថយចុះកម្រិតមធ្យមនៃ SPECC1L ប៉ះពាល់ដល់ការស្អិតរបស់កោសិកា ខណៈដែលការថយចុះយ៉ាងខ្លាំងនាំឱ្យ apoptosis (រូបភាព 8) ។
(A–F') កោសិកាគ្រប់គ្រង (A, C, E) និង SPECC1L-kd (B, D, F) ព្យាបាលដោយ PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) ឬ SC-79 activator (E, F) ការព្យាបាល .កោសិកាគ្រប់គ្រងដែលមិនព្យាបាលគឺគូប (A) ជាមួយនឹងស្នាមប្រឡាក់កោសិកា β-cat ធម្មតា (A') ខណៈពេលដែលកោសិកា kd ត្រូវបានពន្លូត (B) ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃស្នាមប្រឡាក់ β-cat (B')។បន្ទាប់ពីការទប់ស្កាត់ផ្លូវ PI3K-AKT កោសិកាគ្រប់គ្រងបានពន្លូត (C) ជាមួយនឹងការពង្រីក β-cat (C') ខណៈពេលដែលកោសិកា kd ចាប់ផ្តើមឆ្លងមេរោគ apoptosis (D) ស្រដៀងទៅនឹងអំប្រ៊ីយ៉ុងដែលផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំងរបស់យើង និងបង្ហាញ β-cat ដែលត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំង។ស្នាមប្រឡាក់ (D') ។បន្ទាប់ពីការធ្វើឱ្យសកម្មនៃផ្លូវ PI3K-AKT កោសិកាត្រួតពិនិត្យនៅតែជាគូប (E) និងមានស្នាមប្រឡាក់ β-cat (E') ធម្មតា ខណៈពេលដែលកោសិកា kd បានបង្ហាញរូបរាងកោសិកា (F) និង β-cat (F') ស្នាមប្រឡាក់ដែលមានភាពប្រសើរឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ ដែលបង្ហាញពី (G) កម្រិតនៃការផ្លាស់ប្តូររាងក្រឡានៅក្នុង (AF) ត្រូវបានគណនាដោយប្រើសមាមាត្រជុំក្រឡា (CCR) នៃវិមាត្រវែងបំផុត (ប្រវែង) និងវិមាត្របញ្ឈរដែលត្រូវគ្នា (ទទឹង) ដោយប្រើកម្មវិធី MetaMorph ។កោសិកាដែលមិនបានព្យាបាល (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3.46) គឺវែងជាងកោសិកាត្រួតពិនិត្យ (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10–13) ។ការរារាំងរបស់ wort នៃផ្លូវ PI3K-AKT នៅក្នុងកោសិកាគ្រប់គ្រងគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបណ្តាលឱ្យមានការពន្លូតស្រដៀងគ្នានៅក្នុងរូបរាងកោសិកា (CCR=3.61, p<2.4×10-9) ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការធ្វើឱ្យសកម្ម AKT ដោយ SC-79 នៅក្នុងកោសិកា SPECC1L-kd បានស្ដារការពន្លូតកោសិកាឡើងវិញទៅកម្រិតគ្រប់គ្រង (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10–12) ។ការព្យាបាល Wortmannin នៃកោសិកា SPECC1L-kd បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើង apoptosis ប៉ុន្តែមិនមានការកើនឡើងបន្ថែមទៀតនៃការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (CCR=3.60) បើប្រៀបធៀបទៅនឹង kd ដែលមិនបានព្យាបាល (CCR=3.46, ns) ឬកោសិកាគ្រប់គ្រងដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ wortmannin (3.61) ដែលត្រូវបានអង្កេតនៅក្នុង .ns = មិនសំខាន់ទេ។+/- ការវាស់វែង SEM សម្រាប់ 50 កោសិកាត្រូវបានបង្ហាញ។ភាពខុសគ្នានៃស្ថិតិត្រូវបានគណនាដោយប្រើតេស្ត t របស់សិស្ស។
(ក) ការបង្ហាញគ្រោងការណ៍នៃការរារាំង និងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃផ្លូវ PI3K-AKT ដែលបណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរ AJ និងការសង្គ្រោះរៀងៗខ្លួន។(ខ) គំរូដែលបានស្នើឡើងសម្រាប់ស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីន AKT ដោយ SPECC1L ។
CNCCs Premigratory តម្រូវឱ្យ AJ lysis បំបែកចេញពីកោសិកាសរសៃប្រសាទ anterior fold neuroepithelial1,15,32។ការកើនឡើងស្នាមប្រឡាក់នៃសមាសធាតុ AJ និងការបាត់បង់ការចែកចាយ asymmetric apical-basal AJ នៅក្នុងកោសិកាដែលខ្វះ SPECC1L ទាំងនៅក្នុង vitro និង in vivo រួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹងភាពជិតខាងរាងកាយរបស់ SPECC1L ទៅ β-catenin បង្ហាញថាមុខងារ SPECC1L ដើម្បីរក្សាបាននូវស្ថេរភាពមូលដ្ឋាន AJ ឱ្យបានត្រឹមត្រូវសម្រាប់ សាច់ដុំរបស់អង្គការ។actin cytoskeleton ។ការផ្សារភ្ជាប់គ្នានៃ SPECC1L ជាមួយ actin cytoskeleton និង β-catenin និងការកើនឡើងនៃចំនួន condensed actin filaments ក្នុងករណីដែលមិនមាន SPECC1L គឺស្របជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃដង់ស៊ីតេ AJ ។លទ្ធភាពមួយទៀតគឺថាចំនួនសរសៃ actin កើនឡើងនៅក្នុងកោសិកាដែលខ្វះ SPECC1L នាំឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរភាពតានតឹងរវាងកោសិកា។ដោយសារតែភាពតានតឹងកោសិកាប៉ះពាល់ដល់ឌីណាមិក AJ 33 ការផ្លាស់ប្តូរវ៉ុលអាចបណ្តាលឱ្យមានការសាយភាយកាន់តែច្រើន AJ 34 ។ដូច្នេះការផ្លាស់ប្តូរណាមួយនឹងប៉ះពាល់ដល់ស្រទាប់ CNCC ។
Wnt1 ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទដំបូងដែលផ្តល់ការកើនឡើងដល់កោសិកាសរសៃប្រសាទ។ដូច្នេះ ការតាមដានខ្សែសង្វាក់ Wnt1-cre សម្គាល់ទាំងមុន និងការធ្វើចំណាកស្រុក NCC35។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ Wnt1 ក៏សម្គាល់ក្លូនជាលិកាខួរក្បាល dorsal ផងដែរដែលបានមកពីផ្នត់សរសៃប្រសាទដំបូង 35,36 ដែលធ្វើឱ្យវាទំនងជាថាស្នាមប្រឡាក់ E9.5 របស់យើងសម្រាប់សញ្ញាសម្គាល់ Wnt1 នៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទបើកចំហមិនមែនជា CNCC ទេ។ស្នាមប្រឡាក់វិជ្ជមានរបស់យើងសម្រាប់សញ្ញាសម្គាល់ NCC AP2A និង SOX10 បានបញ្ជាក់ថាផ្នត់សរសៃប្រសាទដែលលាតត្រដាងនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងបំប្លែង Specc11 ពិតជាមាន CNCC មែន។លើសពីនេះ ដោយសារ AP2A និង SOX10 គឺជាសញ្ញាសម្គាល់នៃ NCC នៃការធ្វើចំណាកស្រុកដំបូង ស្នាមប្រឡាក់វិជ្ជមានបានបង្ហាញថាកោសិកាទាំងនេះគឺជា CNCC ក្រោយការធ្វើចំណាកស្រុក ដែលមិនអាចត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ដោយ E9.5 ។
ទិន្នន័យរបស់យើងណែនាំថាបទប្បញ្ញត្តិម៉ូលេគុលនៃ AJ ដោយ SPECC1L ត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយសញ្ញា PI3K-AKT ។សញ្ញា AKT ត្រូវបានកាត់បន្ថយនៅក្នុងកោសិកា និងជាលិកាដែលខ្វះខាត SPECC1L ។ការរកឃើញដោយ Fantauzzo et al ។គាំទ្រតួនាទីផ្ទាល់សម្រាប់ការផ្តល់សញ្ញា PI3K-AKT នៅក្នុង morphogenesis craniofacial ។(2014) បានបង្ហាញថាការខ្វះខាតនៃការធ្វើឱ្យសកម្មនៃសញ្ញា PI3K-AKT ដែលមានមូលដ្ឋានលើ PDGFRα នាំឱ្យមាន phenotype ក្រអូមមាត់ឆែប។យើងក៏បង្ហាញផងដែរថាការរារាំងផ្លូវ PI3K-AKT គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីផ្លាស់ប្តូរ AJ និងរូបរាងកោសិកានៅក្នុងកោសិកា U2OS ។ស្របតាមការរកឃើញរបស់យើង Cain et al ។37 បានបង្ហាញថាការថយចុះនៃផ្នែករង PI3K α110 នៅក្នុងកោសិកា endothelial បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងស្រដៀងគ្នានៃស្នាមប្រឡាក់ pericellular β-catenin ដែលសំដៅទៅលើការកើនឡើងនៃ "សន្ទស្សន៍ការតភ្ជាប់" ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនៅក្នុងកោសិកា endothelial ដែលសរសៃ actin ត្រូវបានរៀបចំយ៉ាងខ្ពស់រួចហើយ ការបង្ក្រាបផ្លូវ PI3K-AKT បណ្តាលឱ្យមានរូបរាងកោសិការលុង។ផ្ទុយទៅវិញ កោសិកា SPECC1L-kd U2OS បានបង្ហាញរាងក្រឡាដែលពន្លូត។ភាពខុសគ្នានេះអាចជាប្រភេទកោសិកាជាក់លាក់។ខណៈពេលដែលការបង្ក្រាបសញ្ញា PI3K-AKT ជះឥទ្ធិពលជាអចិន្ត្រៃយ៍លើ cytoskeleton actin ឥទ្ធិពលលើរូបរាងកោសិកាត្រូវបានកំណត់ដោយការផ្លាស់ប្តូរភាពតានតឹងដែលបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរដង់ស៊ីតេនិងការរៀបចំនៃសរសៃ actin កណ្តាល។នៅក្នុងក្រឡា U2OS យើងបានប្រើតែការផ្លាស់ប្តូររាងក្រឡាជាសញ្ញាសម្គាល់នៃការផ្លាស់ប្តូរ និងការស្ដារ AJ ដែលគ្មាន SPECC1L ។សរុបសេចក្តី យើងសន្មត់ថាការរារាំងផ្លូវ AKT ក្នុងកង្វះ SPECC1L បង្កើនស្ថេរភាព AJ និងកាត់បន្ថយការខូចទ្រង់ទ្រាយនៅក្នុង CNCC ។
គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍កម្រិត pan-AKT ត្រូវបានកាត់បន្ថយនៅក្នុង vitro និង in vivo បន្ថែមពីលើកម្រិត phosphorylated 473-AKT ក្នុងករណីអវត្តមាននៃ SPECC1L ដែលបង្ហាញពីបទប្បញ្ញត្តិនៃសញ្ញា PI3K-AKT នៅកម្រិតនៃស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីន AKT ឬការផ្លាស់ប្តូរ។ហ្សែន SPECC1L និង MID1 ដែលទាំងពីរត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងរោគសញ្ញា Opitz/GBBB អ៊ិនកូដប្រូតេអ៊ីនដែលធ្វើឱ្យ microtubules មានស្ថេរភាព 18,22 ។យន្តការដែល SPECC1L និង MID1 សម្រុះសម្រួលស្ថេរភាព microtubule មិនត្រូវបានយល់ច្បាស់នោះទេ។ក្នុងករណី SPECC1L ស្ថេរភាពនេះរួមបញ្ចូលទាំងការពង្រឹង acetylation នៃសំណុំរងនៃ microtubules 18 ។វាអាចទៅរួចដែលថា SPECC1L ប្រើយន្តការស្រដៀងគ្នាដើម្បីធ្វើឱ្យមានស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតដូចជា AKT ។វាត្រូវបានបង្ហាញថា acetylation នៃសំណល់ lysine នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន AKT នាំឱ្យមានការថយចុះនៃការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មភ្នាស និង phosphorylation38 ។លើសពីនេះ ការផ្សព្វផ្សាយបន្តនៃខ្សែសង្វាក់ K63 នៅសំណល់ lysine ដូចគ្នានៅលើ AKT គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មភ្នាសរបស់វា និងការធ្វើឱ្យសកម្ម39,40។ក្នុងចំណោមកត្តាជាច្រើនដែលធ្វើអន្តរកម្មជាមួយប្រូតេអ៊ីន SPECC1L ដែលត្រូវបានសម្គាល់នៅក្នុងអេក្រង់កូនកាត់ពីរប្រភេទ yeast ឆ្លងខ្ពស់ បួន - CCDC841, ECM2942, APC និង UBE2I43 - ត្រូវបានជាប់ពាក់ព័ន្ធនៅក្នុងការផ្លាស់ប្តូរប្រូតេអ៊ីន ឬស្ថេរភាពតាមរយៈ ubiquitination ឬ suoylation ។SPECC1L អាចពាក់ព័ន្ធនឹងការកែប្រែក្រោយការបកប្រែនៃសំណល់ AKT lysine ដែលប៉ះពាល់ដល់ស្ថេរភាព AKT ​​។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ តួនាទីសំខាន់របស់ SPECC1L ក្នុងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្ម និងស្ថេរភាពនៃប្រូតេអ៊ីន AKT នៅតែត្រូវបានបកស្រាយ។
ពិការភាពធ្ងន់ធ្ងរនៅក្នុងកន្សោម SPECC1L នៅក្នុង vivo បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនូវស្នាមប្រឡាក់សញ្ញាសម្គាល់ AJ និងការបិទបាំង CNCC ក៏ដូចជាការបង្កើន apoptosis និងភាពស្លាប់នៃអំប្រ៊ីយ៉ុងដំបូង។របាយការណ៍ពីមុនបានបង្ហាញថា សត្វកណ្ដុរដែលមានកម្រិតកើនឡើងនៃ apoptosis ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងពិការភាពនៃសរសៃប្រសាទ 44,45,46,47 និងពិការភាព craniofacial 48 ។វាត្រូវបានគេណែនាំថា ការស្លាប់កោសិកាច្រើនពេកនៅក្នុងផ្នត់សរសៃប្រសាទ ឬក្លនលូនអាចបណ្តាលឱ្យមានចំនួនកោសិកាមិនគ្រប់គ្រាន់ដែលត្រូវការសម្រាប់ចលនា morphogenetic ត្រឹមត្រូវ 48,49,50។ផ្ទុយទៅវិញ ខ្សែកោសិកាដែលខ្វះខាត SPECC1L របស់យើងជាមួយនឹងកន្សោម SPECC1L ដែលត្រូវបានកាត់បន្ថយកម្រិតមធ្យម បានបង្ហាញតែការផ្លាស់ប្តូរ AJ ដោយគ្មានភស្តុតាងនៃការកើនឡើងចំនួនកោសិកាស្លាប់។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការរារាំងគីមីនៃផ្លូវ PI3K-AKT នៅក្នុងកោសិកា Kd ទាំងនេះបានបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើង apoptosis ។ដូច្នេះ ការថយចុះកម្រិតមធ្យមនៅក្នុងកន្សោម ឬមុខងារ SPECC1L ធានាបាននូវការរស់រានរបស់កោសិកា។នេះ​គឺ​ស្រប​នឹង​ការ​សង្កេត​ឃើញ​ថា អំប្រ៊ីយ៉ុង​បំប្លែង Specc11 ដ៏​កម្រ​ដែល​គេច​ផុត​ពី​ការ​ចាប់​ខ្លួន​នៅ St.E9.5—ប្រហែលជាដោយសារតែការថយចុះប្រសិទ្ធភាពនៃការចាប់យកហ្សែន—អាចបិទបំពង់សរសៃប្រសាទរបស់ពួកគេ ហើយឈប់ដំណើរការនៅពេលក្រោយ ជាញឹកញាប់មានពិការភាព craniofacial (រូបភាព S3)។ស្របជាមួយនេះផងដែរគឺការកើតឡើងដ៏កម្រនៃអំប្រ៊ីយ៉ុង Specc1l heterozygous ជាមួយនឹងការមិនធម្មតានៃ craniofacial - ប្រហែលជាដោយសារតែការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការចាប់យកហ្សែន - ក៏ដូចជាការរកឃើញនៅក្នុងត្រី zebrafish ដែលមួយក្នុងចំណោមពីរ SPECC1L orthologues (specc1lb) បណ្តាលឱ្យមានបាតុភូតនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងយឺត រួមទាំងការបាត់បង់។ ថ្គាមក្រោម និង ឆែបទ្វេភាគី ៥១.ដូច្នេះ ការផ្លាស់ប្តូរមុខងារនៃការបាត់បង់មុខងារ heterozygous SPECC1L ដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងអ្នកជំងឺរបស់មនុស្សអាចបណ្តាលឱ្យមានការចុះខ្សោយនៃមុខងារ SPECC1L ក្នុងអំឡុងពេល morphogenesis craniofacial ដែលគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីពន្យល់ពីការឆែប orofacial របស់ពួកគេ។បទប្បញ្ញត្តិដែលមានមូលដ្ឋានលើ SPECC1L នៃទំនាក់ទំនងអន្តរកោសិកាក៏អាចដើរតួនាទីនៅក្នុង palatogenesis និងការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ pharyngeal arches ។ការសិក្សាបន្ថែមអំពីមុខងារ SPECC1L នឹងជួយបកស្រាយតួនាទីនៃទំនាក់ទំនងអន្តរកោសិកាបណ្តោះអាសន្ននៅក្នុង CNCC កំឡុងពេលបិទបំពង់សរសៃប្រសាទក្នុងចលនាកោសិកា neuroepithelial និង morphogenesis craniofacial ។
ការគ្រប់គ្រង osteosarcoma U2OS និងកោសិកា SPECC1L-kd ត្រូវបានពិពណ៌នាពីមុន (Saadi et al., 2011)។អង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង SPECC1L ក៏ត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈពីមុនដែរ (Saadi et al., 2011)។អង់ទីករប្រឆាំងβ-catenin (ទន្សាយ; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (កណ្តុរ; 1:1000; បច្ចេកវិទ្យាសញ្ញាកោសិកា, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , កាលីហ្វ័រញ៉ា), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) និង β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ត្រូវបានគេប្រើដូចដែលបានពិពណ៌នា។.សរសៃ Actin ត្រូវបានប្រឡាក់ដោយសារធាតុ Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado)។
កោសិកាគ្រប់គ្រង U2OS និងកោសិកា SPECC1L-kd ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងស្តង់ដារ DMEM ជាតិស្ករខ្ពស់ដែលបន្ថែមដោយសេរ៉ូម bovine ទារក 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA)។សម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរ AJ កោសិកា 2 x 105 ត្រូវបានបណ្តុះនៅលើកញ្ចក់ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ហើយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា។កោសិកាត្រូវបានប្រមូលតាមចំណុចពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញផ្សេងៗគ្នា៖ 4 ម៉ោងបន្ទាប់ពីគ្រាប់ពូជ (t = 1) 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីគ្រាប់ពូជ (t = 2) ចំណុចប្រសព្វដោយគ្មានការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (t = 3) ការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (t = 4) ។ , 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (t = 5) និង 48 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា (t = 6) (រូបភាព 1, 2, 3) ។ដើម្បីកែប្រែផ្លូវ PI3K-AKT កោសិកាត្រូវបានដាំដុះតាមកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញជាមួយនឹង PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ឬ SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota)។ឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមានសារធាតុគីមីត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរជារៀងរាល់ថ្ងៃ។
ការថតដោយស៊ុមមួយត្រូវបានធ្វើឡើងនៅលើការគ្រប់គ្រងផ្ទាល់ និងកោសិកា KD ក្រោមលក្ខខណ្ឌវប្បធម៌ធម្មតា ហើយរូបភាពកម្រិតពណ៌ដំណាក់កាលត្រូវបានប្រមូលរៀងរាល់ 10 នាទីសម្រាប់រយៈពេល 7 ថ្ងៃ។រូបភាពត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ដាក់បញ្ច្រាស Leica DM IRB ដែលគ្រប់គ្រងដោយកុំព្យូទ័រដែលបំពាក់ដោយដំណាក់កាលមេកានិច និងគោលបំណង 10 × N-PLAN ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងកាមេរ៉ា QImaging Retiga-SRV ។កំឡុងពេលថតរូបភាព វប្បធម៌កោសិកាត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 37°C ក្នុងបរិយាកាសសើមជាមួយនឹង 5% CO2។
ខ្សែកោសិកា ES អន្ទាក់ពីរ DTM096 និង RRH048 ពីមជ្ឈមណ្ឌលធនធាន Mouse Mutant ក្នុងតំបន់ (UC Davis, CA) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតបន្ទាត់កណ្ដុរខ្វះខាត Specc11 ដែលត្រូវបានកំណត់ Specc1lgtDTM096 និង Specc1lgtRRH046។ដោយសង្ខេប កោសិកា 129/REJ ES ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុង C57BL6 blastocysts ។លទ្ធផល កណ្តុរឈ្មោលត្រូវបានបង្កាត់ជាមួយសត្វកណ្ដុរ C57BL6 ញី ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណពូជដែលមានពណ៌ថ្នាំកូត agouti ។វត្តមាននៃការបញ្ចូលវ៉ិចទ័រអន្ទាក់ហ្សែនត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ heterozygotes ។សត្វកណ្តុរត្រូវបានរក្សាទុកនៅលើផ្ទៃខាងក្រោយចម្រុះនៃ 129/REJ;C57BL6 ។ទីតាំងនៃកន្លែងបញ្ចូលនៃវ៉ិចទ័រអន្ទាក់ហ្សែនត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយ RT-PCR លំដាប់ហ្សែន និងការបំពេញបន្ថែមហ្សែន (រូបភាពទី 1 បន្ថែម)។ដើម្បីតាមដានខ្សែសង្វាក់ CNCC នៃកណ្តុរ Specc1lGT heterozygous ទ្វេរដង ROSAmTmG (#007576) និងកណ្តុរ Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ត្រូវបានឆ្លងកាត់ដើម្បីបង្កើត ROSAmTmG និង Wnt1-Cre allele mullele នៅក្នុង Speccemការពិសោធន៍ទាំងអស់លើសត្វកណ្ដុរត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមពិធីការដែលត្រូវបានអនុម័តដោយគណៈកម្មាធិការថែទាំ និងប្រើប្រាស់សត្វរបស់វិទ្យាស្ថាននៃសាកលវិទ្យាល័យ Kansas Medical Center។
អំប្រ៊ីយ៉ុងត្រូវបានជួសជុលក្នុង (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) រយៈពេល 60 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់ពីការជួសជុលនៅក្នុងដំណោះស្រាយស្នាមប្រឡាក់ X-gal (5 mM ប៉ូតាស្យូម ferricyanide, 5 mM ប៉ូតាស្យូម ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) ការអភិវឌ្ឍន៍ស្នាមប្រឡាក់ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 37 ° C ។ .°C ក្នុងរយៈពេល 1-6 ម៉ោង។អំប្រ៊ីយ៉ុងត្រូវបានជួសជុលក្រោយក្នុង 4% PFA និងមើលឃើញ។
ចំពោះការលាបពណ៌បស្ចិមប្រទេស កោសិកាត្រូវបានគេដាក់នៅក្នុងបណ្តុំលីលីអកម្ម (Promega, Fitchburg, WI) ដែលត្រូវបានបន្ថែមដោយល្បាយនៃ HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)។Lysates ត្រូវបានដំណើរការលើ 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ជែលត្រៀមរួចជាស្រេច (Bio-Rad, Hercules, CA) និងផ្ទេរទៅភ្នាស Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA)។ភ្នាសត្រូវបានរារាំងនៅក្នុងទឹកដោះគោ 5% នៅក្នុង PBS ដែលមាន 0.1% Tween ។អង្គបដិប្រាណត្រូវបាន incubated ពេញមួយយប់នៅ 4 ° C ឬរយៈពេលមួយម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបង្កើតសញ្ញា។សម្រាប់ភាពស៊ាំ អំប្រ៊ីយ៉ុងត្រូវបានជួសជុលពេញមួយយប់ក្នុងកម្រិត 4% PFA/PBS និងរក្សាទុកដោយសារធាតុ cryopreserved។ការបំបែកជាលិកាត្រូវបានរារាំងនៅក្នុង PBS ដែលមានសេរ៉ូមពពែធម្មតា 1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) និង 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ហើយបន្ទាប់មក incubated នៅសីតុណ្ហភាព 4°C នៅក្នុង incubator កំឡុងពេល យប់។ជាមួយនឹងការប្រឆាំងនឹងអង្គបដិប្រាណ និងអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ fluorescent (1:1000) រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ផ្នែកដែលមានស្នាមប្រឡាក់ត្រូវបានដាក់ក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកមាស ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ហើយរូបភាពរាបស្មើត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍បង្រួបបង្រួម Leica TCS SPE ។ការចាក់ថ្នាំបង្ការរោគនីមួយៗត្រូវបានអនុវត្តជាការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបីលើផ្នែកជុំវិញនៃអំប្រ៊ីយ៉ុងដែលផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងតិចពីរ។ការពិសោធន៍តំណាងត្រូវបានបង្ហាញ។
កោសិកាត្រូវបាន incubated នៅក្នុង RIPA buffer ដែលបានកែប្រែ (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA និង HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ដោយសង្ខេប lysates ត្រូវបានបន្សុតជាមុនជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីន G magnetic beads (Life Technologies, Carlsbad, CA) ហើយបន្ទាប់មក incubed មួយយប់នៅ 4° C. ជាមួយនឹង anti-SPECC1L ឬ IgG protein beads ត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ដើម្បីទាញយក SPECC1L និងការ blotting ខាងលិចត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ anti អង់ទីករ -β-catenin ដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ ការពិសោធន៍សហ IP ដែលបានបង្ហាញគឺតំណាងឱ្យការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបួន។
កោសិកាវប្បធម៌ថេរ ឬជាលិកាអំប្រ៊ីយ៉ុងកណ្ដុរត្រូវបានផ្តល់ទៅឱ្យមជ្ឈមណ្ឌលមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងនៅមជ្ឈមណ្ឌលវេជ្ជសាស្ត្រនៃសាកលវិទ្យាល័យ Kansas ។ដោយសង្ខេប គំរូត្រូវបានបង្កប់នៅក្នុងជ័រ EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) វត្ថុធាតុ polymerized ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 60°C និងផ្នែកនៅ 80 nm ដោយប្រើ Leica UC7 ultramicrotome ដែលបំពាក់ដោយកាំបិតពេជ្រ។ផ្នែកត្រូវបានគេមើលឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន JEOL JEM-1400 ដែលបំពាក់ដោយកាំភ្លើង 100 kV Lab6 ។
តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីដកស្រង់អត្ថបទនេះ: Wilson, NR et al ។កង្វះនៃ SPECC1L នាំឱ្យមានការបង្កើនស្ថេរភាពនៃសន្លាក់ spliced ​​​​និងកាត់បន្ថយ delamination នៃកោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial crest ។វិទ្យាសាស្ត្រ។៦, ១៧៧៣៥;doi: 10.1038/srep17735 (2016) ។
Saint-Jeanne, J.-P.ការបញ្ចូលនិងភាពខុសគ្នានៃសរសៃប្រសាទ។(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006)។
Cordero, DR et al ។កោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial នៅក្នុងចលនា: តួនាទីរបស់ពួកគេក្នុងការអភិវឌ្ឍ craniofacial ។ទិនានុប្បវត្តិអាមេរិចនៃពន្ធុវិទ្យាវេជ្ជសាស្រ្ត។ផ្នែក A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011) ។
Boland, RP Neurocristopathia: ការលូតលាស់និងការអភិវឌ្ឍន៍របស់វាជាង 20 ឆ្នាំ។គ្រូពេទ្យកុមារ។រោគវិទ្យា។មន្ទីរពិសោធន៍។ថ្នាំ។១៧, ១–២៥ (១៩៩៧)។
Mangold E., Ludwig KU និង Noten MM របកគំហើញនៅក្នុងហ្សែននៃការឆែប orofacial ។និន្នាការក្នុងថ្នាំម៉ូលេគុល 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011)។
Minu, M. និង Riley, FM យន្តការម៉ូលេគុលនៃការផ្លាស់ប្តូរកោសិកាសរសៃប្រសាទ cranial និងការធ្វើលំនាំកំឡុងពេលអភិវឌ្ឍ craniofacial ។ការអភិវឌ្ឍន៍ 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010) ។
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH និង Murray, JK Cleft lip and palate: ការយល់ដឹងពីឥទ្ធិពលហ្សែន និងបរិស្ថាន។យោបល់ធម្មជាតិ។ពន្ធុវិទ្យា 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011)។
Ingram, CR et al ។ភាពមិនប្រក្រតីនៃកោសិកាស្បែក អវយវៈ និងតំបន់ craniofacial នៅក្នុងសត្វកណ្តុរដែលខ្វះសារធាតុ interferon-regulating factor-6 (Irf6)។ពូជពង្សជាតិ។38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006)។
Peyrard-Janvid, M. et al ។ការផ្លាស់ប្តូរលេចធ្លោនៅក្នុង GRHL3 បណ្តាលឱ្យមានរោគសញ្ញា van der Waord និងធ្វើឱ្យខូចដល់ការវិវត្តនៃ periderm មាត់។Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014) ។
Harris, MJ និង Juriloff, DM ធ្វើបច្ចុប្បន្នភាពបញ្ជីនៃការផ្លាស់ប្តូរកណ្តុរដែលមានពិការភាពក្នុងការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ និងឈានទៅរកការយល់ដឹងអំពីហ្សែនពេញលេញនៃការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ។ការស៊ើបអង្កេតពិការភាពពីកំណើត។ផ្នែក A, គ្លីនិក និងម៉ូលេគុល Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010) ។
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling ធ្វើនិយ័តកម្មការរស់រានមានជីវិត និងការរីកសាយនៅក្នុងការអភិវឌ្ឍគ្រោងឆ្អឹងតាមរយៈផ្លូវ intracellular ដែលពឹងផ្អែកលើ p53 ។ការអភិវឌ្ឍន៍ហ្សែន 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014) ។
Kopp, AJ, Green, ND និង Murdoch, JN Disheveled: ទំនាក់ទំនងនៃការពង្រីកការបញ្ចូលគ្នាទៅនឹងការបិទបំពង់សរសៃប្រសាទ។និន្នាការនៃសរសៃប្រសាទ។26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)។