សមាសធាតុគីមីនៃបំពង់ដែកអ៊ីណុក 347 ការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រលោមលោកនៃប្រូតេអ៊ីន leukocyte antigen-A (HLA-A) របស់មនុស្សដែលឆ្លើយតបដោយ interferon ដោយប្រើប្រាស់សារធាតុចម្រុះដែលភ្ជាប់គ្នា (CLMS)

សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
គ្រាប់រំកិលបង្ហាញអត្ថបទបីក្នុងមួយស្លាយ។ប្រើប៊ូតុងខាងក្រោយ និងបន្ទាប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយ ឬប៊ូតុងឧបករណ៍បញ្ជាស្លាយនៅចុងបញ្ចប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយនីមួយៗ។

ការ​ពិពណ៌នា​ពី​ផលិតផល

បំពង់ដែកអ៊ីណុក 347L ដែកថ្នាក់ទី: SS347L

ប្រព័ន្ធផ្តល់សញ្ញា interferon ជំរុញឱ្យមានការឆ្លើយតប cytokine ដ៏រឹងមាំចំពោះជួរដ៏ធំទូលាយនៃសញ្ញារោគវិទ្យា និងខាងក្នុងពីបរិស្ថាន ដែលបណ្តាលឱ្យមានការបង្កើតនូវបណ្តុំនៃប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible ។យើងបានអនុវត្ត DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ដើម្បីរកមើលអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនថ្មីនៅក្នុងដែននៃប្រូតេអ៊ីនដែលបង្កដោយ interferon ។បន្ថែមពីលើប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible ដែលរំពឹងទុក យើងក៏បានកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រលោមលោករវាង interferon និង intramolecular adducts នៃប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible canonical ដូចជា MX1, USP18, OAS3 និង STAT1 ។យើងបានផ្តោតលើការបញ្ជាក់អ័រតូហ្គោននៃសំណុំប្រលោមលោកនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible ដែលបង្កើតឡើងដោយប្រូតេអ៊ីន HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ដោយប្រើ co-immunoprecipitation និងការសិក្សាបន្ថែមរបស់ពួកគេដោយប្រើគំរូឌីណាមិកម៉ូលេគុល។ការធ្វើគំរូនៃឌីណាមិកអនុលោមភាពនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនបានបង្ហាញពីកន្លែងអន្តរកម្មជាច្រើនដែលឆ្លុះបញ្ចាំងពីអន្តរកម្មដែលបានកំណត់នៅក្នុងការរកឃើញរបស់ CLMS ។ជាមួយគ្នានេះ យើងធ្វើបទបង្ហាញពីការសិក្សាសាកល្បងនៃ CLMS ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណសញ្ញាថ្មីដែលស្មុគ្រស្មាញដោយ interferon ហើយទន្ទឹងរង់ចាំការប្រើប្រាស់កាន់តែទូលំទូលាយនៃ CLMS ដើម្បីកំណត់ថាមវន្តថ្មីនៃអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងមីក្រូបរិស្ថាននៃដុំសាច់។
មុនពេលការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំសម្របខ្លួនចាប់ផ្តើម ប្រព័ន្ធការពារពីខាងក្នុងរបស់ម្ចាស់ផ្ទះដំឡើងការឆ្លើយតបអង់ទីប៊ីយ៉ូទិកដែលសម្របសម្រួលដោយក្រុមគ្រួសារនៃ cytokines អាល់ហ្វា-helical សម្ងាត់ដែលហៅថា interferons (IFNs) ។ប្រភេទ I IFN ចាត់ថ្នាក់ IFNα និង IFNβ ធ្វើឱ្យសកម្មនៃការឆ្លើយតបកោសិកា រួមទាំងរដ្ឋប្រឆាំងមេរោគ ប្រូប៉ូតូទិក ប្រូរលាក និងរដ្ឋប្រឆាំងការរីកសាយ។នៅក្នុងមនុស្ស 13 ប្រភេទរងនៃ IFNα ត្រូវបានគេស្គាល់ ទាំងអស់ជាចង្កោមនៅលើក្រូម៉ូសូម 91។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល មានតែ IFNα2 ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានសិក្សាសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ក្នុងការព្យាបាល។ថ្មីៗនេះ ការយកចិត្តទុកដាក់ពិសេសត្រូវបានបង់ទៅលើការស្រាវជ្រាវលើប្រភេទរងផ្សេងទៀតនៃ IFNα។ការសិក្សាថ្មីៗនេះបានបង្ហាញថា IFNα14 គឺជា isoforms ដ៏មានប្រសិទ្ធភាពបំផុតមួយក្នុងការរឹតបន្តឹងការចម្លង HBV2 និង HIV-13,4 បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទរង IFNα2 canonical ។
វាត្រូវបានបង្កើតឡើងដែលស្មុគ្រស្មាញទទួល interferon ប្រភេទ I ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (IFNAR1 និង IFNAR2) បង្កឱ្យមានការបញ្ជូនសញ្ញាដែលសម្របសម្រួលដោយ Janus kinases TYK2 និង JAK15,6 ។ឧបករណ៍បំលែងសញ្ញា Janus kinases phosphorylate និងឧបករណ៍រំញោចប្រូតេអ៊ីនចម្លង (STAT1 និង STAT2) នៅលើសំណល់ tyrosine ដើម្បីផ្តួចផ្តើម SH2 domain-mediated heterodimerization6.ក្រោយមក IRF9 ភ្ជាប់ STAT heterodimers ដើម្បីបង្កើតជាស្មុគស្មាញ trimeric នៃហ្សែន IFN-stimulated factor 3 (ISGF3) ដែលប្តូរទីតាំងទៅស្នូល និងជំរុញការចម្លងនៃហ្សែនរំញោច interferon (ISGs) 5,6,7,8 ជាង 2000 ។
ISGs បង្កើតជាឆ្អឹងខ្នងនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំពីខាងក្នុង ជាពិសេសក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការវាយប្រហារដោយមេរោគ។ក្នុងនាមជាខ្សែការពារទីមួយប្រឆាំងនឹងការឆ្លងមេរោគ កោសិកាដាក់ពង្រាយអន្តរកម្មយ៉ាងទូលំទូលាយនៃប្រូតេអ៊ីនកោសិកាជាមួយនឹងសកម្មភាពជីវសាស្រ្តយ៉ាងទូលំទូលាយ។ប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះរួមមានអ្នកទទួលការទទួលស្គាល់គំរូ ម៉ូលេគុលផ្តល់សញ្ញា កត្តាចម្លង និងប្រូតេអ៊ីនដែលមានមុខងារប្រឆាំងមេរោគដោយផ្ទាល់ ក៏ដូចជានិយតករអវិជ្ជមាននៃការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ 9.ព័ត៌មានជាច្រើនអំពីសកម្មភាព ISG បានមកពីអេក្រង់មុខងារដោយប្រើអេក្រង់ overexpression screens 10,11 ឬបច្ចេកទេសបំបិទហ្សែន (siRNA, RNAi និង CRISPR)12,13 ដែល ISGs នីមួយៗត្រូវបានបញ្ចេញ ឬរារាំង ហើយសកម្មភាពរបស់ពួកគេត្រូវបានសាកល្បងលើមេរោគផ្សេងៗ។ទោះបីជាការសិក្សាទាំងនេះបានកំណត់លក្ខណៈសម្បត្តិប្រឆាំងមេរោគនៃ ISGs នីមួយៗក៏ដោយ យន្តការម៉ូលេគុលមូលដ្ឋាននៃ ISG នីមួយៗនៅតែមិនស្គាល់ច្រើន។វាត្រូវបានទទួលយកជាទូទៅថាប្រូតេអ៊ីនជាច្រើនមានអន្តរកម្មជាមួយ cytokines មួយឬច្រើនដើម្បីធានាបាននូវសកម្មភាពពេញលេញ ដូច្នេះទាំង ISGs ធ្វើអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់ ឬអន្តរកម្មរបស់វាត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយប្រូតេអ៊ីនកោសិកា។ជាឧទាហរណ៍ ការសិក្សាស្រាវជ្រាវ proteomics ដែលត្រូវបានភ្ជាប់ដោយ photocrosslinked ថ្មីៗនេះបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ATPase VCP/p97 ជាដៃគូអន្តរកម្ម IFITM3 ដ៏សំខាន់ ដែលការរារាំងរបស់វានាំទៅរកពិការភាពក្នុងការតម្រៀប lysosomal ការផ្លាស់ប្តូរ និង cotransport នៃ IFITM3 ជាមួយនឹងភាគល្អិតមេរោគ 14 ។ដោយប្រើ immunoprecipitation យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ VAPA ដែលជាប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង vesicle ជាដៃគូអន្តរកម្មជាមួយ IFITM1/2/3 ដែលសម្របសម្រួលភាពចាស់ទុំនៃមេរោគដែលសម្របសម្រួលដោយកូលេស្តេរ៉ុល ហើយនេះត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការសិក្សាមួយផ្សេងទៀតដោយប្រើប្រព័ន្ធកូនកាត់ yeast two-hybrid ។ជំនួយផ្នែកវិទ្យាសាស្ត្រ ១៥, ១៦ .
ដំណើរការជីវសាស្រ្តជាមូលដ្ឋានដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការទប់ស្កាត់ការឆ្លង និងការបំប្លែងសាហាវគឺការបង្ហាញអង់ទីហ្សែន ដែលត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយម៉ូលេគុល histocompatibility complex (MHC) សំខាន់ៗ។Peptides (អាស៊ីតអាមីណូ 8-12 វែង) ពីប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានកាត់ចោល បញ្ចប់មុនអាយុ ឬបត់ខុសត្រូវបានផ្ទុកទៅក្នុង MHC-I heterodimer (មានខ្សែសង្វាក់ធ្ងន់ និងស្រាល MHC-I ហៅថា β-2-microglobulin; β2M) 17,18 ។ឧបករណ៍កាត់ MHC-I ដែលមានស្ថេរភាពជាលទ្ធផលត្រូវបានបញ្ជូនទៅផ្ទៃកោសិកា ដែលពួកគេបង្ហាញ peptides ខាងក្នុងកោសិកាទៅកាន់កោសិកា CD8+ T (កោសិកា T cells) 17 ។កោសិកា T ទទួលស្គាល់ និងបំផ្លាញធាតុបង្កជំងឺ និងកោសិកាដែលផ្ទុកអង់ទីហ្សែនជាក់លាក់នៃដុំសាច់។អាស្រ័យហេតុនេះ ភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ និងកោសិកាដុំសាច់ច្រើនតែរារាំងដំណើរការបង្ហាញអង់ទីហ្សែន ដើម្បីជៀសវាងការឃ្លាំមើលប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ។លើសពីនេះទៀត MHC-I ត្រូវបានកាត់បន្ថយក្នុង 40-90% នៃដុំសាច់មនុស្ស ហើយជារឿយៗត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការព្យាករណ៍ខ្សោយជាង 19 ។
ហ្សែនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការឆ្លើយតបទៅនឹងភ្នាក់ងារបង្កជំងឺត្រូវតែប្តូរយ៉ាងលឿនរវាងស្ថានភាពនៃការសម្រាក និងស្ថានភាពនៃការចម្លងសកម្ម។ដូច្នេះ ប្រូតេអ៊ីនកោសិកាជាច្រើនត្រូវបានគេសន្មត់ថាពាក់ព័ន្ធនឹងការឆ្លើយតបទៅនឹងតម្រូវការ IFN ខ្ពស់ក្នុងរយៈពេលខ្លី រួមទាំងការកែប្រែ និងការកែប្រែនៃប្រូម៉ូសិនក្រូម៉ាទីន 20,21 ។ការសិក្សាភាគច្រើនបានផ្តោតលើការកំណត់អត្តសញ្ញាណដៃគូប្រូតេអ៊ីន ISG បុគ្គលនៅក្នុងវត្តមានរបស់ IFN ។ការសិក្សា proteomic និង transcriptomic ជាច្រើននៅក្នុងប្រព័ន្ធកោសិកាគំរូបានបំភ្លឺពីឥទ្ធិពលនៃ IFN លើទិដ្ឋភាពកោសិកា។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាមានការយល់ដឹងកាន់តែច្រើនឡើងអំពីសក្ដានុពលដែលបង្កឡើងដោយ interferons ក៏ដោយ ក៏យើងនៅតែដឹងតិចតួចអំពីការចូលរួមរបស់ ISGs ។នៅពេលពិចារណាពីភាពស្មុគ្រស្មាញ និងសក្ដានុពលដែលពឹងផ្អែកលើពេលវេលានៃការបញ្ជូនសញ្ញា interferon សំណួរពីរកើតឡើង៖ (i) តើវាអាចទៅរួចទេក្នុងការរក្សាលំនឹង និងអន្ទាក់ស្មុគស្មាញពហុប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការបញ្ជូនសញ្ញាលឿន ហើយ (ii) តើអន្តរកម្មទាំងនេះអាចត្រូវបានគូសផែនទីចូលទៅក្នុងលំហ 3D ដែរឬទេ?
ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាទាំងនេះ យើងបានអនុវត្ត disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) រួមជាមួយនឹង mass spectrometry (CLMS) ដើម្បីសិក្សាពីបណ្តាញអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនដែលបណ្ដាលមកពី IFNα និងសក្ដានុពលរបស់វា។DSS បន្ថែមចំណង covalent រវាងសំណល់ជិតនៃប្រូតេអ៊ីន និង/ឬប្រូតេអ៊ីនស្មុគស្មាញនៅក្នុង vivo ។ការវិភាគ MS ជាបន្តបន្ទាប់បង្ហាញពីទីតាំងឆ្លងភ្ជាប់ជាក់លាក់ដែលឆ្លុះបញ្ចាំងពីភាពជិតគ្នានៃតំបន់នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់មួយ ហៅថា តំណភ្ជាប់ខាងក្នុង ឬផ្នែករងនៅក្នុងស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន ហៅថាទំនាក់ទំនងអន្តរកម្ម។ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តនេះ យើងបានកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនប្រលោមលោកជាច្រើន ក៏ដូចជាបណ្តាញអន្តរកម្មពហុប្រូតេអ៊ីនដែលបណ្តាលមកពី interferon ។តាមរយៈការសាកល្បងបន្ថែមទៀតនូវសំណុំរងនៃអន្តរកម្មថ្មីទាំងនេះ យើងបង្ហាញថា H2BFS (H2B histone-type FS; តទៅនេះហៅថា H2B) និង MDN1 ដើរតួជាដៃគូចងសម្រាប់ HLA-A។
កោសិកា Flo-1 គឺជាផ្នែកមួយនៃគំរូ vitro នៃ adenocarcinoma បំពង់អាហារដែលគេស្គាល់ថាល្អបំផុត ដោយសារពួកវាធ្វើត្រាប់តាមលក្ខណៈសំខាន់ៗនៃដុំសាច់ក្នុងបំពង់អាហារ 22,23 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមែនដុំសាច់ទាំងអស់សុទ្ធតែមានភាពស៊ាំនោះទេ ហើយដើម្បីកំណត់ថាតើកោសិកា Flo-1 ឆ្លើយតបទៅនឹងការព្យាបាល interferon ដែរឬទេ យើងបានព្យាបាលកោសិកា Flo-1 ជាមួយនឹង 10 ng/ml IFNα រយៈពេល 72 ម៉ោង។កោសិកា Flo-1 បានបង្ហាញពីការចាប់ផ្តើមដំបូងនៃ pSTAT1 និង IRF1 ដោយចាប់ផ្តើម 2 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល និងបន្តរយៈពេល 72 ម៉ោង ជាមួយនឹងការថយចុះអាស្រ័យលើពេលវេលានៃកម្រិតស្ថានីនៃ IRF1 (រូបភាព 1A) ។ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, និង ISG15) ត្រូវបានរកឃើញថាត្រូវបានជំរុញយ៉ាងខ្លាំងបន្ទាប់ពី 6 ម៉ោង ដោយធ្វើត្រាប់តាមការឆ្លើយតបនៃដំណាក់កាលកណ្តាល និងចុងបុរាណទៅនឹង IFNα (រូបភាពទី 1A) ។ជាមួយគ្នា ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថាគំរូកោសិកានេះអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាការឆ្លើយតបរបស់ interferon ។
ប្រតិកម្មប្រូតេអ៊ីនឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៅក្នុងកោសិកា Flo-1 បន្ទាប់ពីការព្យាបាល IFNα ។(ក) កន្សោមប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងកោសិកា Flo-1 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ 10 ng/ml IFNα រយៈពេល 2, 6, 24, 48 និង 72 ម៉ោងត្រូវបានវិភាគដោយ immunoblot ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណ ISG ដែលបានបង្ហាញ។(ខ) Coomassie blue stained SDS-PAGE gels of whole cell extracts after cross-linking with DSS for the pointed time and concentrations.(C) ភ្នាក់ងារ immunoblot ដែលត្រូវបានពិនិត្យជាមួយនឹងអង់ទីករ p53(DO-1) ពីគំរូដូចគ្នា ដើម្បីវាយតម្លៃកម្រិតនៃការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងរវាងប្រូតេអ៊ីន។
ដើម្បីចាប់យកទិដ្ឋភាពអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងទីតាំង យើងបានប្រើ DSS ដែលជាភ្នាក់ងារទំនាក់ទំនងឆ្លងដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយ ដោយសារភាពជ្រាបចូលនៃភ្នាសខ្ពស់របស់វា និងរយៈពេលប្រតិកម្មខ្លី។ពេលវេលាប្រតិកម្មខ្លីជាងនេះ ជួយការពារការកកើតនៃប្រូតេអ៊ីនដែលភ្ជាប់គ្នាច្រើន ដោយហេតុនេះអាចរក្សាបាននូវស្ថេរភាពនៃ crosslinker ។ដើម្បីកំណត់កំហាប់ DSS ដ៏ប្រសើរបំផុត និងជៀសវាងការភ្ជាប់ហួសកម្រិត យើងបានលាតត្រដាងកោសិកាដំបូងទៅ 5, 2.5, និង 1 mM DSS សម្រាប់ 5, 10, 5 និង 30 នាទីរៀងៗខ្លួន ហើយបានវិភាគលីសេតដោយ Coomassie-stained SDS-PAGE (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ។កោសិកា lysates ហាក់ដូចជាមានទំនាក់ទំនងឆ្លងគ្នាយ៉ាងខ្លាំងនៅកំហាប់ទាបបំផុត និងនៅពេលវេលាខ្លីបំផុត។ដូច្នេះ DSS ត្រូវបាន titrated ទៅ 1, 0.5 និង 0.1 mM ក្នុងរយៈពេល 5 នាទី (រូបភាព 1B) ។ការភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ដ៏ល្អប្រសើរត្រូវបានគេសង្កេតឃើញជាមួយនឹង 0.5 mM DSS រយៈពេល 5 នាទី ហើយលក្ខខណ្ឌទាំងនេះត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់កោសិកាដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα។លើសពីនេះទៀតរូបភាពទី 1C បង្ហាញពីប្លុកលោកខាងលិចដែលត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើអង់ទីករ p53 (DO-1) ដើម្បីវាយតម្លៃកម្រិតនៃការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងរវាងប្រូតេអ៊ីន។
កោសិកា Flo-1 ត្រូវបានព្យាបាលដោយ 10 ng/ml IFNα រយៈពេល 24 ម៉ោងមុនពេលបន្ថែម crosslinker ។កោសិកាដែលជាប់ទាក់ទងគ្នាត្រូវបាន lysed ជាបន្តបន្ទាប់ដោយ proteolysis ពីរជំហាន ហើយប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានដំណើរការដោយ FASP (រូបភាព 2) 24,25 ។សារធាតុ tryptic peptides ឆ្លងត្រូវបានវិភាគដោយម៉ាស់ spectrometry (រូបភាព 2) ។បន្ទាប់មកវិសាលគម MS/MS ត្រូវបានផ្គូផ្គងទៅនឹងលំដាប់ប្រូតេអ៊ីន និងកំណត់បរិមាណជាមួយ MaxQuant26,27។សារធាតុ peptides ឆ្លងត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណពីវិសាលគមដែលទទួលបានដោយប្រើកម្មវិធី SIM-XL ហើយសមាសធាតុនីមួយៗត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាទៅក្នុងបណ្តាញស្មុគស្មាញដោយប្រើ xQuest28 និង SIM-XL29 open source software pipelines (រូបភាព 2) ។SIM-XL កំណត់អត្តសញ្ញាណអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន ខ្សែសង្វាក់ខាងក្នុង និងខ្សែសង្វាក់នីមួយៗនៅក្នុងល្បាយប្រូតេអ៊ីនសាមញ្ញ ឬស្មុគស្មាញ ហើយផ្តល់ស្គ្រីបសម្រាប់ការមើលឃើញអន្តរកម្មនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីន។លើសពីនេះ វាចាត់ចំណាត់ថ្នាក់នីមួយៗជាពិន្ទុ ID យោងទៅតាមគុណភាពវិសាលគម MS/MS29។អន្តរកម្ម និងស្មុគ្រស្មាញប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនដែលអាចទុកចិត្តបានខ្ពស់ជាច្រើនត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណ ហើយសំណុំនៃអន្តរកម្មថ្មីត្រូវបានស៊ើបអង្កេតបន្ថែមទៀតដោយប្រើ co-immunoprecipitation និងការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់នៃស្មុគស្មាញដោយប្រើគំរូឌីណាមិកម៉ូលេគុល (MD) (រូបភាព 2) 30, 31 ។
ទិដ្ឋភាពទូទៅនៃវិធីសាស្រ្ត CLMS ។កោសិកា Flo-1 ត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα 10 ng/ml សម្រាប់រយៈពេល 24 ម៉ោងបន្ទាប់មកដោយការភ្ជាប់ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងទីតាំងដោយប្រើ DSS បន្តដោយកោសិកា lysis និង trypsinization ។សំណាកដែលជាប់ទាក់ទងគ្នាត្រូវបានវិភាគដោយប្រើឧបករណ៍វាស់ម៉ាស់ Orbitrap និងយកគំរូបន្ថែមទៀតសម្រាប់ការបំបែកសារធាតុ peptide មុនគេក្នុងអំឡុងពេល LC-MS/MS ។សារធាតុ peptides ពីរដែលភ្ជាប់គ្នាត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណពីវិសាលគមដែលទទួលបានដោយប្រើ Spectrum Recognition Machine នៃកម្មវិធី Crosslinked Peptides (SIM-XL) ហើយសមាសធាតុទាំងអស់ត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាទៅក្នុងបណ្តាញស្មុគស្មាញដោយប្រើបំពង់គណនា។ត្រងចេញអន្តរកម្មភាពជឿជាក់ទាប ដោយផ្អែកលើពិន្ទុវិជ្ជមានមិនពិត (FDR)។អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនដែលមានភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់ថ្មីជាច្រើនត្រូវបានបញ្ជាក់បន្ថែមដោយប្រើការពង្រឹងភាពស៊ាំរួម ហើយការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់នៃស្មុគស្មាញត្រូវបានពិនិត្យដោយប្រើគំរូឌីណាមិកម៉ូលេគុល (MD) ។
ចំនួនសរុបនៃ ~30,500 និង ~28,500 peptides ត្រូវបានរកឃើញដោយប្រើ MaxQuant នៅក្នុងសំណាក IFNα ដែលមិនមានការរំញោច និងរំញោចរៀងៗខ្លួន (តារាងបន្ថែម S1 រូបភព 3A)។ការចែកចាយប្រវែង peptide ក្នុងករណីទាំងពីរបានបង្ហាញពីសមាមាត្រខ្ពស់នៃ peptides ធំជាង ដែលបង្ហាញពីវត្តមានរបស់ peptides ឆ្លង (រូបភាព 3B,C)។លើសពីនេះទៀតសមាមាត្រធំនៃ peptides ធំជាងមានវត្តមាននៅក្នុងជួរ 40-55 នៅក្នុងគំរូដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα (រូបភាព 3C) ។ការធ្វើផែនទីប្រូតេអ៊ីនប្រឆាំងនឹងអាំងតង់ស៊ីតេនៃ log2 បានបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីនដែលជំរុញដោយ interferon បុរាណមានច្រើនក្រៃលែងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងគំរូដែលមិនបានព្យាបាល រួមមាន MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, និង HLA-F (រូបភាព 3D) ។ការវិភាគផ្លូវសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនច្រើនជាង 3 ដងដែលសំបូរទៅដោយការឆ្លើយតបទៅនឹងការព្យាបាល IFNα ដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យផ្លូវ Reactome បានបង្ហាញថាការបង្ហាញ និងដំណើរការអង់ទីករដែលសម្របសម្រួល MHC-I គឺជាផ្លូវលេចធ្លោបំផុត (រូបភាព 3E) ។ដោយអនុលោមតាមរបាយការណ៍មុន ការឆ្លើយតបប្រឆាំងមេរោគដែលត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ OAS និង ISG15 ក៏ដូចជា IFNα/β និងសញ្ញា cytokine ស្ថិតក្នុងចំណោមផ្លូវដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម។លើសពីនេះទៀត lysine- និង serine-specific protein cross-links ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណពី MS/MS spectra ដែលទទួលបានដំបូងដោយប្រើ SIM-XL ។ការសិក្សាថ្មីៗនេះបានរាយការណ៍ថា ISGs ចំនួន 104 ដែលលាតសន្ធឹងលើមេរោគចំនួន 20 ពីប្រភេទមេរោគ 9 ដោយការវិភាគមេតានៃការសិក្សាអំពី ISG overexpression បុគ្គលក្នុង 5 cell type9 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដើម្បីយកឈ្នះលើដែនកំណត់នៃការគណនានៃការពិនិត្យមើលសំណុំទិន្នន័យធំ យើងបានចាប់ផ្តើមជាមួយនឹងសំណុំទិន្នន័យតូចជាង ដើម្បីស្វែងរកអន្តរកម្មដែលអាចកើតមានរវាងបញ្ជីហ្សែន IRDS ដែលរាយការណ៍ដោយ Padaria et al ដែលភាគច្រើនជា ISGs ។
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនឆ្លងតំណភ្ជាប់ដែលបង្ហាញដោយឌីផេរ៉ង់ស្យែលក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹង IFNα (ទិន្នន័យដែលទទួលបានពី MaxQuant) ។(ក) ដ្យាក្រាម Venn តំណាងឱ្យចំនួន peptides ទូទៅ និងផ្តាច់មុខដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង IFNα14 ដែលបានព្យាបាល និងមិនបានព្យាបាលសំណាក Flo-1 ។ការចែកចាយប្រវែង Peptide នៃគំរូដែលមិនបានព្យាបាល (B) និង IFNα បានព្យាបាល (C) សំណាកឆ្លងកាត់។(ឃ) ផែនទីកំដៅតំណាងឱ្យ log2 (អាំងតង់ស៊ីតេ LFQ) រវាងកោសិកា Flo-1 ដែលមិនបានព្យាបាល និង IFNα14 ។បន្ទះខាងឆ្វេងបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនដែលសកម្មបំផុតនៅក្នុងវត្តមានរបស់ IFNα ។(ង) អ៊ីស្តូក្រាមតំណាងឱ្យផ្លូវពង្រឹងចំនួន 20 បន្ទាប់ពីការព្យាបាល IFNα ។មូលដ្ឋានទិន្នន័យផ្លូវ Reactome បានវិភាគការផ្លាស់ប្តូរច្រើនជាងបួនដងនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនដែលឆ្លើយតប IFNα ដែលត្រូវបានកែសម្រួល។
ការរំញោច Interferon-mediated ISG ត្រូវបានចងក្រងជាឯកសារយ៉ាងល្អ ប៉ុន្តែនៅកម្រិតម៉ូលេគុល វាត្រូវបានគេយល់តិចតួចពីរបៀបដែលប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះឈានដល់កម្រិតដ៏ធំទូលាយនៃមុខងារជីវសាស្ត្រ។យើងបានស៊ើបអង្កេតអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនជាមួយនឹងកម្រិតខ្ពស់នៃទំនុកចិត្តរវាង ISGs ដែលគេស្គាល់។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណបណ្តាញរួមមាន MX1, USP18, ROBO1, OAS3, និង STAT1 ប្រូតេអ៊ីនដែលបង្កើតជាស្មុគស្មាញដ៏ធំមួយក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការព្យាបាល IFNα (រូបភាពទី 4 តារាង S2) 32,33,34 ។សំខាន់បំផុត អន្តរកម្មទាំងនេះត្រូវបានគេរកឃើញនៅក្នុង trilicates ទាំងអស់ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα និងមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងគំរូដែលមិនបានព្យាបាល ដោយបង្ហាញថាពួកគេត្រូវបានបង្កើតឡើងជាពិសេសក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការព្យាបាល IFNα។វាត្រូវបានគេដឹងថា STAT1 ប្រតិចារិកគ្រប់គ្រងការបញ្ចេញមតិនៃ ISGs ទាំងនេះ ប៉ុន្តែអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយ ISGs នៅកម្រិតប្រូតេអ៊ីនមិនត្រូវបានគេសិក្សាទេ។រចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃ STAT1 បានបង្ហាញថាដែន helical របស់វា (CCD) មិនពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មជាមួយ DNA ឬ protomers កំឡុងពេលបង្កើត dimers35 ទេ។α-helices ទាំងនេះបង្កើតបានជារចនាសម្ព័ន្ធ helix helical ដែលផ្តល់នូវផ្ទៃ hydrophilic លើសលុបសម្រាប់អន្តរកម្មកើតឡើង 35 .នៅក្នុងទិន្នន័យ CLMS របស់យើង យើងបានសង្កេតឃើញថា អន្តរកម្មភាគច្រើនជាមួយ STAT1 បានកើតឡើងនៅក្នុងដែន SH2 មុន CCD, ដែនតំណភ្ជាប់ ឬកន្ទុយស្ថានីយ C (សំណល់ 700-708) (រូបភាព 4A) ។ការសិក្សាពីមុនបានរាយការណ៍ថា USP18 ភ្ជាប់ទៅ CCD និង DNA-binding domain (DBD) នៃ STAT2 ហើយត្រូវបានជ្រើសរើសទៅផ្នែករងនៃប្រភេទ I interferon receptor IFNAR2 ដើម្បីសម្របសម្រួលការរារាំងប្រភេទ I interferon signaling 24 ។ទិន្នន័យរបស់យើងក៏បានបង្ហាញផងដែរថាដែនកាតាលីករ USP18 មានអន្តរកម្មជាមួយ STAT1 DBD (រូបភាពទី 4A, D) ដែលបង្ហាញថាទាំង STAT1 និង STAT2 អាចដើរតួក្នុងការទាក់ទាញ USP18 ទៅ IFNAR2 ។
បណ្តាញប្រូតេអ៊ីន - ប្រូតេអ៊ីន ISG កំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងកោសិកាឆ្លងដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα។(ក) គ្រោងអន្តរកម្ម 2D ដែលបង្ហាញពីអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន (បង្កើតក្នុងកម្មវិធី SIM-XL) ដោយមានបន្ទាត់តំណាងឱ្យអន្តរកម្មអន្តរម៉ូលេគុល (ការកាត់ផ្តាច់តំណទៅ 3.5)។ដែននៃអត្តសញ្ញាណផ្សេងគ្នាត្រូវបានសម្គាល់ដោយ color32 របស់ពួកគេ៖ ដែន MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) និង GED (569–660) ។ដែន OAS3៖ OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) និង OAS1_C (903-108)។ដែន ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) និង fn3 (777–864) ។វាល STAT1៖ STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) និង STAT1_TAZ2bind (715–739)។(ខ) កម្មវិធីមើលរាងជារង្វង់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលភ្ជាប់គ្នា (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 និង STAT1) ជាមួយនឹងអន្តរកម្ម និងអន្តរកម្មដែលមានស្លាកពណ៌ខៀវ និងក្រហមរៀងៗខ្លួន។កម្រិតនៃតំណភ្ជាប់ឆ្លងត្រូវបានកំណត់នៅ 3.5 ។ចំនុចចំនុចបង្ហាញពីគេហទំព័រអន្តរកម្ម STAT1 ជាមួយ MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) និង OAS3 (F) ក៏ដូចជាគេហទំព័រអន្តរកម្ម K ឬ S រវាង peptides ទាំងពីរ។នៅក្នុងរូបភាព កម្រិតពិន្ទុឆ្លងកាត់តំណត្រូវបានកំណត់ទៅ 3.0 ។(G) កន្លែងអន្តរកម្មផ្សេងៗរវាងដែន STAT1 និង OAS3 DI ដែលដាក់លើរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនរបស់ពួកគេនៅក្នុង PyMol (ប្រព័ន្ធក្រាហ្វិកម៉ូលេគុល PyMOL កំណែ 2.0 Schrödinger, LLC ។ );STAT1 (pdb id: 1bf533) និង OAS3 (pdb id: 4s3n34) ។កម្មវិធី) ។
អ៊ីសូហ្វមពីរនៃ USP18 ត្រូវបានពិពណ៌នានៅក្នុងមនុស្ស ដែលជាប្រូតេអ៊ីនប្រវែងពេញដែលមានទីតាំងនៅក្នុងស្នូល និងអ៊ីសូហ្វមដោយគ្មានដែន N-terminal, USP18-sf ដែលត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅក្នុង cytoplasm និង nucleus 36 ។លើសពីនេះទៀត N-terminus ត្រូវបានព្យាករណ៍ថាមិនមានរចនាសម្ព័ន្ធនិងមិនតម្រូវឱ្យមានសកម្មភាព isopeptidase ឬការចង ISG1537 ទេ។អន្តរកម្មភាគច្រើនដែលកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងការសិក្សារបស់យើងមានទីតាំងនៅ N-terminus នៃប្រូតេអ៊ីន ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មទាំងនេះពាក់ព័ន្ធនឹង USP18 ប្រវែងពេញ (រូបភាព 4A, D) ហើយដូច្នេះទំនងជាកើតឡើងនៅក្នុងស្នូល។លើសពីនេះទៅទៀត ទិន្នន័យរបស់យើងក៏បង្ហាញថា N-terminus មានឯកទេសសម្រាប់អន្តរកម្មរវាងប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន។ទីតាំងចង IFNAR2 ស្ថិតនៅចន្លោះសំណល់ 312-368 ហើយគួរអោយកត់សំគាល់គឺគ្មានប្រូតេអ៊ីនណាមួយនៅក្នុងស្មុគស្មាញចងភ្ជាប់ទៅនឹងតំបន់នេះទេ (រូបភាព 4A) 37,38 ។ទិន្នន័យទាំងនេះដែលបានយករួមគ្នាបង្ហាញថាដែនចង IFNAR2 ត្រូវបានប្រើទាំងស្រុងដោយប្រូតេអ៊ីនទទួល។លើសពីនេះទៀត មានតែ OAS3 និង ROBO1 ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានគេរកឃើញថាត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងដែនខាងលើនៃបណ្តាញភ្ជាប់ N-terminus និង IFNAR2 (រូបភាព 4A) ។
ROBO1 ជាកម្មសិទ្ធិរបស់គ្រួសារ immunoglobulin (Ig) នៃម៉ូលេគុលបញ្ជូនសញ្ញា transmembrane និងមានដែន Ig ចំនួនប្រាំ និងដែន fibronectin (Fn) ចំនួនបីនៅក្នុងតំបន់ extracellular ។ដែន extracellular ទាំងនេះត្រូវបានបន្តដោយតំបន់ភ្នាស-ជិត និង helix transmembrane តែមួយ 39 ។ តំបន់ intracellular ដែលមិនមានរចនាសម្ព័ន្ធមានទីតាំងនៅ C-terminus និងមានគំនូរតាមលំដាប់អភិរក្សដែលសម្របសម្រួលការចងប្រូតេអ៊ីន effector 39 ។តំបន់ដែលលាតសន្ធឹងពីអាស៊ីតអាមីណូ ~ 1100 ទៅ 1600 ភាគច្រើនមានបញ្ហា។យើងបានរកឃើញថា MX1 មានអន្តរកម្មជាមួយ ROBO1 តាមរយៈ Ig, Fn និងដែន intracellular ខណៈពេលដែលអន្តរកម្មភាគច្រើនជាមួយ STAT1 កើតឡើងរវាង CCD, linker domain និង C-terminus នៃ ROBO1 (រូបភាព 4A,E)។ម្យ៉ាងវិញទៀត អន្តរកម្មជាមួយតំបន់ភ្ជាប់ DI, DIII, និង OAS3 ត្រូវបានចែកចាយពាសពេញប្រូតេអ៊ីន ROBO1 (រូបភាព 4A)។
ក្រុមគ្រួសារប្រូតេអ៊ីន oligoadenylate synthase (OAS) ទទួលយក និងចង RNA ពីរជាន់ក្នុងកោសិកា (dsRNA) ឆ្លងកាត់ការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់ និងសំយោគ 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 ។វាត្រូវបានគេរកឃើញថាក្នុងចំណោម OASs ទាំងបី OAS3 បង្ហាញពីភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់បំផុតសម្រាប់ dsRNA និងសំយោគបរិមាណតិចបំផុតនៃ 2-5 As ដែលអាចធ្វើសកម្មភាព RNase L ហើយដោយហេតុនេះកំណត់ការចម្លងមេរោគ 41 ។ក្រុមគ្រួសារ OAS មានផ្ទុកនូវដែន នុយក្លេអូទីត ផ្ទេរតាស ស្រដៀងនឹងប៉ូលីមេរ៉ាសបេតា (pol-β)។ការស្រាវជ្រាវពីមុនបានបង្ហាញថាសកម្មភាពកាតាលីករនៃដែន C-terminal (DIII) គឺពឹងផ្អែកលើដែន dsRNA-binding (DI) ដែលត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការធ្វើឱ្យសកម្មនៃ OAS342 ។យើងបានសង្កេតឃើញថាដែន DI និង DII នៃ OAS3 មានអន្តរកម្មជាមួយ CCD និងតំបន់ប្រសព្វតូចមួយរវាង SH2 និង STAT1 TAD (រូបភាព 4A, F) ។ការត្រួតលើគ្នាលើបណ្តាញតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ផ្សេងៗគ្នានៅលើរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនបានបង្ហាញពីអន្តរកម្មរវាង β-សន្លឹក និងរង្វិលជុំ DBD STAT1 និងហោប៉ៅបើកចំហ ឬបែហោងធ្មែញដែលបង្កើតឡើងដោយសំណល់ 60–75 នៅក្នុងដែន DI នៃ OAS3 (រូបភាព 4G) ។ការតំរង់ទិសនៃប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងស្មុគស្មាញក៏បានបង្ហាញថាគ្មានអន្តរកម្មជាមួយ OAS3 រំខានដល់សមត្ថភាពចង DNA នៃដែន DI របស់វា (រូបភាព S1A) នោះទេ។លើសពីនេះ ដែន N-terminal នៃ GTPase MX1 មានអន្តរកម្មយ៉ាងទូលំទូលាយជាមួយដែន DI និង DIII នៃ OAS3 (រូបភាព 4A)។យើងក៏បានសង្កេតឃើញអន្តរកម្មរវាង OAS1 និង MX1 ក្នុងការធ្វើឡើងវិញទាំងបី IFNα ដែលបានព្យាបាល ដែលដែន OAS1 តែមួយ (ក៏សកម្មសកម្ម) បានធ្វើអន្តរកម្មជាមួយដែន MX1 ទាំងបី (រូបភាព S2A, B) ។
ប្រូតេអ៊ីន MX គឺជាផ្នែកមួយនៃក្រុមគ្រួសារដ៏ធំនៃ GTPases ដូច dynein ដែលមានដែន N-terminal GTPase ដែលភ្ជាប់ និង hydrolyzes GTP ដែលជាដែនកម្រិតមធ្យមដែលសម្របសម្រួលការជួបប្រជុំគ្នាដោយខ្លួនឯង និងខ្សែរ៉ូត C-terminal leucine ដែលដើរតួជា GTPase (LZ )domain effector domain25,43.MX1 ភ្ជាប់ទៅផ្នែករងនៃវត្ថុធាតុ polymerase មេរោគ ដើម្បីទប់ស្កាត់ការចម្លងហ្សែនមេរោគ 43 ។អេក្រង់កូនកាត់ពីរនៃផ្សិតដែលបានរាយការណ៍ពីមុនបានបង្ហាញថា PIAS1-ភ្ជាប់ MX1 រារាំងសកម្មភាពហ្សែនដែលសម្របសម្រួលដោយ STAT1 ដោយរារាំងសកម្មភាពភ្ជាប់ DNA ហើយក៏មានសកម្មភាព SUMO E344,45 ligase ផងដែរ។នៅទីនេះ យើងបង្ហាញថា MX1 ភ្ជាប់ទៅ STAT1 (រូបភាព 4C, D) ទោះបីជាយ៉ាងណា អន្តរកម្មនេះប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាពហ្សែនដែលសម្របសម្រួលដោយ STAT1 ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹង IFNα ត្រូវការការសិក្សាបន្ថែម។លើសពីនេះទៀត យើងក៏បានរកឃើញថា MX1 មានអន្តរកម្មជាមួយ IFIT3 និង DDX60 ក្នុងការធ្វើឡើងវិញទាំងបី IFNα ដែលបានព្យាបាល (រូបភាព S2C) ។
DDX60 គឺជា IFN-induced cytoplasmic helicase ដែលពីមុនត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាដើរតួនាទីនៅក្នុងការរិចរិលឯករាជ្យនៃ RNA46 មេរោគ។វាធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ RIG-I និងធ្វើឱ្យការបញ្ជូនសញ្ញារបស់វាមានលក្ខណៈជាក់លាក់មួយ 46. DDX60 មានដែនឧទ្ធម្ភាគចក្រ DEXD/H-Box និងដែនឧទ្ធម្ភាគចក្រ C-terminal ដែលភ្ជាប់ RNA មេរោគ និង DNA47 ។ភាគច្រើននៃអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយ MX1 និង IFIT3 កើតឡើងនៅក្នុងតំបន់ N- និង C-terminal ដ៏វែងដោយគ្មានដែន Canonical ឬគំនូរ (រូបភាព S2E, F) ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ MX1 ក៏ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងដែនឧទ្ធម្ភាគចក្រ DEXD/H-Box (រូបភាព S2E) ផងដែរ។ប្រូតេអ៊ីននៃគ្រួសារ IFIT មានច្បាប់ចម្លងនៃគំនូរ helix-turn-helix ប្លែកៗដែលហៅថា tetrapeptide repeat (TPR) ។IFIT3 ត្រូវបានរកឃើញថាជាម៉ូឌុលវិជ្ជមាននៃសញ្ញា RIG-I ហើយហេតុដូច្នេះហើយបានជាធាតុផ្សំនៃស្មុគស្មាញ MAVS ។សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថា IFIT3 និង DDX60 មានអន្តរកម្មជាចម្បងនៅក្នុងតំបន់រវាង TPR 3-6 នៃ IFIT3 ហើយអាចដើរតួក្នុងការផ្តល់សញ្ញា RIG-I/MAVS (រូបភាព S2F)។
ដោយមើលឃើញថាការពិនិត្យមើល proteome ទាំងមូលគឺពឹងផ្អែកខ្លាំងលើការគណនា នោះយើងបានពិនិត្យមូលដ្ឋានទិន្នន័យ UniProt របស់មនុស្សទាំងមូលសម្រាប់វត្តមាននៃការកើតឡើងម្តងទៀតដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα។នៅក្នុងការចម្លងនេះ យើងបានរកឃើញបណ្តាញអន្តរកម្មដែលអាចទុកចិត្តបានខ្ពស់ជាច្រើនសម្រាប់ HLA-A។ការវិភាគនៃផ្លូវប្រូតេអ៊ីនដែលកំណត់ដោយ MS/MS spectra បានបង្ហាញថាដំណើរការ និងការបង្ហាញអង់ទីករដែលមានមូលដ្ឋានលើ MHC-I គឺជាផ្លូវចម្បងដែលបង្កឡើងដោយ interferon (រូបភាព 3D) ។ដូច្នេះហើយ យើងបានផ្តោតលើការសិក្សាអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីននៃម៉ូលេគុល MHC-I ជាមួយនឹងកម្រិតនៃភាពជឿជាក់ខ្ពស់ចំពោះគំរូដែលភ្ជាប់គ្នាទាំងអស់។HLA មានដែន α1, α2 និង α3 និងខ្សែសង្វាក់ពន្លឺ ហើយ microglobulin β2 (β2m) គឺជាប្រូតេអ៊ីន chaperone ថេរ 49 ។នៅពេលដែលបានប្រមូលផ្តុំនៅក្នុង reticulum endoplasmic, HLA គឺមិនស្ថិតស្ថេរក្នុងអវត្តមាននៃ peptide ligands50 ។ចង្អូរភ្ជាប់ peptide ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយដែន α1 និង α2 ដែលមិនមានរចនាសម្ព័ន្ធច្រើន និងមិនមានរចនាសម្ព័ន្ធក្នុងទម្រង់មិន peptide និងដែន polymorphic α351 តិចជាង។នៅក្នុងវត្តមានរបស់ IFNα យើងបានរកឃើញស្មុគស្មាញ HLA-A ពីរ៖ មួយមានអន្តរកម្មជាមួយ HMGA1 និង H2B (រូបភាពទី 5 តារាង S3) និងមួយទៀតមានអន្តរកម្មជាមួយ MDN1, LRCH4 និង H2B (រូបភាព 6) ។
IFNα បង្កើតបណ្តាញអន្តរកម្ម HLA-A ជាមួយ H2B (H2BFS) និង HMGA1 ។(ក) គ្រោង 2D (បង្កើតក្នុងកម្មវិធី SIM-XL) ដែលពណ៌នាអំពីប្រភេទអន្តរកម្មផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងស្មុគស្មាញ H2B-HLA-A-HMGA1៖ តំណភ្ជាប់ (ពណ៌ខៀវ) តំណភ្ជាប់ (ក្រហម) និងតំណតែមួយ (ខ្មៅ)។.ដែននៃអត្តសញ្ញាណផ្សេងៗគ្នាមានលេខកូដពណ៌ 32: H2B (histone; 2–102) និង MHC-I (MHC_1; 25–203, ក្រុម C1; 210–290 និង MHC_I_C; 337–364) ។កម្រិតនៃតំណភ្ជាប់ឆ្លងត្រូវបានកំណត់នៅ 3.5 ។ចំនុចចំនុចបង្ហាញពីគេហទំព័រអន្តរកម្ម HLA-A ជាមួយ H2B (B) និង HMGA1 (C) ក៏ដូចជាគេហទំព័រអន្តរកម្ម K ឬ S រវាង peptides ទាំងពីរ។នៅក្នុងរូបភាព កម្រិតពិន្ទុឆ្លងកាត់តំណត្រូវបានកំណត់ទៅ 3.0 ។(ឃ) ទំនាក់ទំនងរវាងប្រូតេអ៊ីនដែលបង្ហាញក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A និង HMGA1 នៅក្នុងកម្មវិធី PyMOL ។រចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះត្រូវបានយកគំរូតាមម៉ាស៊ីនមេ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ហើយរចនាសម្ព័ន្ធគំរូសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A និង HMGA1 គឺ 1kx552, 1kj349 និង 2eze55 រៀងគ្នា។
IFNα បង្កើតបណ្តាញអន្តរកម្ម HLA-A ជាមួយ H2B (H2BFS), MDN1 និង LRCH4 ។(ក) តំណភ្ជាប់អន្តរម៉ូលេគុល (ក្រហម) និងអន្តរម៉ូលេគុល (ពណ៌ខៀវ) ដែលបង្ហាញនៅលើផែនទីអន្តរកម្ម 2D (បង្កើតក្នុងកម្មវិធីស៊ីម-XL) ដែលមាន MDN1 តំណាងជារង្វង់។កម្រិតនៃតំណភ្ជាប់ឆ្លងត្រូវបានកំណត់នៅ 3.5 ។ដែននៃអត្តសញ្ញាណផ្សេងគ្នាមានលេខកូដពណ៌ 32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ក្រុម C1; 210–290 និង MHC_I_C; 337–364) និង LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) និង CH (535–641))។(ខ) ទំនាក់ទំនងរវាងប្រូតេអ៊ីនដែលបង្ហាញក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A, LRCH4 និង MDN1 នៅក្នុងកម្មវិធី PyMOL ។រចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះត្រូវបានយកគំរូតាមម៉ាស៊ីនមេ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធគំរូ 1kx552, 1kj349, 6hlu62 និង 6i2665 សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A, LRCH4 និង MDN1 ។ រៀងៗខ្លួន។ចំនុចដែលបង្ហាញគេហទំព័រអន្តរកម្ម K ឬ S សម្រាប់ HLA-A ជាមួយ H2B (C), LRCH4 (D) និង MDN1 (E) ។សម្រាប់ឡូតិ៍ កម្រិតពិន្ទុឆ្លងកាត់តំណត្រូវបានកំណត់ទៅ 3.0 ។
បន្ថែមពីលើការរក្សាភាពសុចរិតនៃហ្សែននេះ អ៊ីស្តូន H2B ក៏ចូលរួមក្នុងបទប្បញ្ញត្តិនៃការចម្លងផងដែរ។ប្រូតេអ៊ីន H2B មានដែនអ៊ីស្តូនកណ្តាល (HFD) ដែលបង្កើតឡើងដោយ α-helices ចំនួនបីដែលបំបែកដោយរង្វិលជុំ និងកន្ទុយ C-terminal 41,52 ។ភាគច្រើននៃអន្តរកម្មជាមួយ H2B កើតឡើងនៅក្នុង α1 helix ដែលផ្តល់នូវ trimerization ជាមួយ HFD heterodimer (រូបភាព 5A, B) ។ទោះបីជា lysins ត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការចង DNA ក៏ដោយ lysins ខ្លះក៏ជាកន្លែងជំនួស acetylation ឬ methylation ផងដែរ។ឧទាហរណ៍ សំណល់ K43, K46, និង K57 ពី H2B មិនពាក់ព័ន្ធនឹងការភ្ជាប់ DNA ដោយផ្ទាល់ទេ ប៉ុន្តែជាគោលដៅនៃការកែប្រែក្រោយការចម្លងផ្សេងៗ53។ដូចគ្នានេះដែរ សំណល់ K44, K47, និង K57 នៅក្នុង H2B អាចដើរតួនាទីជំនួសនៅក្នុងវត្តមានរបស់ IFNα រួមទាំងអន្តរកម្មជាមួយប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត (រូបភាព 5A, B)។លើសពីនេះ អ៊ីស្តូក្រូម៉ូសូម H2B ធ្វើឱ្យសកម្មការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំក្នុងប្រភេទកោសិកាផ្សេងៗ ដើរតួជាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា cytosolic ដើម្បីរកឃើញបំណែក DNA ពីរខ្សែ (dsDNA) ដែលបានមកពីភ្នាក់ងារបង្ករោគ ឬកោសិកាដែលខូច54។នៅក្នុងវត្តមាននៃមេរោគ DNA ការថយចុះ H2B បានរារាំងការផលិត IFN-β និង STAT154 phosphorylation ។H2B ត្រូវបានគេដឹងថាផ្លាស់ទីចូល និងចេញពីស្នូលលឿនជាងអ៊ីស្តូនស្នូលដទៃទៀត 54 ។អន្តរកម្ម H2B ជាមួយ MDN1 និង LRCH4 ក៏ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញផងដែរនៅក្នុងគំរូដែលមិនបានព្យាបាលដែលបានជ្រើសរើស។យើងបានរកឃើញថា HLA-A មានអន្តរកម្មជាមួយ H2B នៅក្នុងសំណាកដែលព្យាបាលដោយ IFNα ទាំងបី និងក្នុងសំណាកធ្វើម្តងទៀតដែលមិនព្យាបាល។ទិន្នន័យទាំងនេះឆ្លុះបញ្ចាំងពីតួនាទីរបស់ H2B នៅក្នុងមុខងារសរីរវិទ្យាជំនួសដោយឯករាជ្យនៃបទប្បញ្ញត្តិប្រតិចារិក។
HMGA1 (ក្រុមចល័តខ្ពស់ AT-Hook 1) ដែលជា nucleoprotein តូចមួយដែលសម្បូរទៅដោយអាស៊ីតអាមីណូដែលជំរុញជំងឺ ត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងការភ្ជាប់ជាមួយ HLA-A ។វាមានកន្ទុយ C-terminal អាស៊ីត និង DBDs បីផ្សេងគ្នាដែលហៅថា AT hooks ព្រោះវាភ្ជាប់ទៅនឹងចង្អូរតូចៗនៃតំបន់ដែលសម្បូរដោយ AT នៅក្នុង dsDNA55,56។ការចងនេះបណ្តាលឱ្យ DNA ពត់ឬត្រង់ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យកត្តាចម្លងតាម Canonical ដើម្បីចូលដំណើរការលំដាប់នៃការយល់ស្របរបស់វា។កន្ទុយស្ថានីយ C ត្រូវបានគេជឿថាពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន និងការជ្រើសរើសកត្តាចម្លង ចាប់តាំងពីអ្នកផ្លាស់ប្តូរការលុបស្ថានីយ C មិនអាចចាប់ផ្តើមការចម្លងបាន 57 ។លើសពីនេះទៅទៀត ដែននេះមានកន្លែង phosphorylation ដែលបានអភិរក្សជាច្រើន ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាស្រទាប់ខាងក្រោមសម្រាប់ kinases 58 ។យើងបានសង្កេតឃើញអន្តរកម្ម HLA-A និង H2B ជាមួយ HMGA1 នៅខាងក្រៅដែន C-terminal ដោយបង្ហាញថាដែន C-terminal ត្រូវបានប្រើជាចម្បងសម្រាប់ការចងកត្តាចម្លង (រូបភាព 5A, C) ។ប្រូតេអ៊ីន HMGA ប្រកួតប្រជែងជាមួយអ៊ីស្តូន H1 សម្រាប់ការភ្ជាប់ទៅនឹងអាដាប់ទ័រ DNA ដោយហេតុនេះបង្កើនភាពងាយស្រួល57។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ វាហាក់ដូចជាថា HMGA ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ histone H2B តាមបណ្តោយ DNA តំណភ្ជាប់ក្នុងការប្រកួតប្រជែងជាមួយ histone H1 ។HMGB1 ជំរុញការបញ្ចេញមតិរបស់ HLA-A, -B, និង -C នៅក្នុងកោសិកា dendritic ដែលនាំទៅដល់ការធ្វើឱ្យសកម្មរបស់ពួកគេ 59 ប៉ុន្តែអន្តរកម្មរវាង HMG និង HLA មិនត្រូវបានគេរាយការណ៍ពីមុនទេ។យើងបានរកឃើញថា HMGA1 មានអន្តរកម្មជាមួយដែន α1 និង α3 នៃ HLA-A ជាមួយនឹងអន្តរកម្មភាគច្រើននៅខាងក្រៅ 3 DBD របស់វា (រូបភាព 5A, C) ។នៅក្នុងដៃរបស់យើង HLA-A ត្រូវបានគេរកឃើញថាត្រូវបានធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងស្នូល (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ហើយបានផ្តល់ឱ្យថា H2B និង HMGA1 ក៏មានវត្តមាននៅក្នុងស្នូលដែរ អន្តរកម្មនេះទំនងជាកើតឡើងនៅក្នុងស្នូល។សារធាតុបន្ថែមជាក់លាក់ដែលវាស់វែងរវាង H2B, HLA-A, និង HMGA1 ត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាព 5D។
អន្តរកម្មភាគច្រើននៃ HLA-A ជាមួយប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតកើតឡើងនៅក្នុងដែន α1 និង α2 របស់វា និងដែន C-terminal ដែលមានបញ្ហា (រូបភាព 6) ។នៅក្នុងឧទាហរណ៍មួយក្នុងចំណោមឧទាហរណ៍ទាំងនេះ យើងបានរកឃើញថា HLA-A មានអន្តរកម្មជាមួយកន្ទុយ N-terminal ដែលមិនប្រក្រតីនៃ LRCH4 (រូបភាព 6A, D) ។LRCH4 គ្រប់គ្រងការធ្វើឱ្យសកម្ម TLR4 និង LPS cytokine induction ដោយហេតុនេះកែប្រែការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំពីខាងក្នុង60,61។វាគឺជាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសជាមួយនឹងការធ្វើឡើងវិញដែលសម្បូរទៅដោយ leucine (LRRs) ប្រាំបួន និង motif homology calmodulin (CH) នៅក្នុង ectodomain របស់វា បន្ទាប់មកដោយ transmembrane domain (TMD) 60 , 62 ។ដែន CH ត្រូវបានរាយការណ៍ដើម្បីសម្របសម្រួលអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន 60 .ការលាតសន្ធឹងនៃអាស៊ីតអាមីណូប្រហែល 300 រវាងដែន LRR និង CH គឺអាចចូលដំណើរការបាន ប៉ុន្តែមិនមានសណ្តាប់ធ្នាប់។ដោយផ្អែកលើមុខងារនៃតំបន់ដែលមិនមានសណ្តាប់ធ្នាប់ជាអ្នកសម្របសម្រួលនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន និងការដឹកជញ្ជូន vesicular 63 យើងបានរកឃើញថាអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនភាគច្រើនកើតឡើងនៅក្នុងតំបន់ដែលមានបញ្ហា។អន្តរកម្មជាមួយ MDN1 ត្រូវបានចែកចាយពាសពេញប្រវែងនៃប្រូតេអ៊ីន រួមទាំងដែន LRR1, LRR6, CH និងតំបន់ចៃដន្យ ខណៈពេលដែល H2B ភ្ជាប់ជាចម្បងទៅនឹងដែន CH (រូបភាព 6A, B)។គួរកត់សម្គាល់ថាគ្មានអន្តរកម្មណាមួយរួមបញ្ចូល TMJ ដែលបង្ហាញពីភាពជាក់លាក់នៃវិធីសាស្រ្ត CLMS (រូបភាព 6A, B) ។
MDN1 ក៏ត្រូវបានកំណត់ថាជាផ្នែកនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន HLA-A (រូបភាព 6A)។វាជាកម្មសិទ្ធិរបស់ក្រុមគ្រួសារប្រូតេអ៊ីន AAA (ATPases ដែលទាក់ទងនឹងសកម្មភាពផ្សេងៗគ្នា) ។នេះគឺជាដែន N-terminal AAA ដូចគ្នាដែលរៀបចំចូលទៅក្នុងរង្វង់ hexameric និងដកកត្តាជួបប្រជុំគ្នាចេញពីផ្នែករង 60S 64 ribosomal ។មើលទៅដូចជា dynein64,65,66 ។លើសពីនេះ តំបន់សម្បូរបែប Asp/Glu ត្រូវបានអនុវត្តដោយដែន MIDAS (គេហទំព័រពឹងផ្អែកលើអ៊ីយ៉ុងដែក)។ដោយសារតែទំហំធំនៃ MDN1 (ប្រហែល 5600 អាស៊ីតអាមីណូ) និងលក្ខណៈមានកម្រិតរបស់វាជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលបានសិក្សាយ៉ាងល្អ គេដឹងតិចតួចអំពីរចនាសម្ព័ន្ធ និងមុខងាររបស់វាចំពោះមនុស្ស។យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ HLA-A, H2B, និង LRCH4 ជាដៃគូចង MDN1 ហើយបង្ហាញការតំរង់ទិសរបស់ពួកគេជាស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង PyMol (រូបភាព 6A, B) ។ប្រូតេអ៊ីនទាំងបីនេះមានអន្តរកម្មជាមួយដែន AAA ដែលជាដែនតំណភ្ជាប់ដូច dynein និងអាចជាដែន MIDAS MDN1 ។នៅក្នុងរបាយការណ៍មុន ការបន្សុតភាពស្និទ្ធស្នាលនៃប្រូតេអ៊ីននុយបានកំណត់ MDN1 ជាប្រូតេអ៊ីនដែលមានទំនាក់ទំនងជាមួយអ៊ីស្តូន H2B67។លើសពីនេះ ការសិក្សាថ្មីៗនេះក៏បានរាយការណ៍ពីអន្តរកម្មរវាង MDN និង HLA-B នៅក្នុងកោសិកា HCT116 ដោយប្រើ affinity-purified mass spectrometry ដោយគាំទ្រដល់ការរកឃើញរបស់យើង68។ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃស្មុគស្មាញនេះនៅក្នុងសំណាកដែលព្យាបាលដោយ IFNα បង្ហាញពីតួនាទីសម្រាប់ MDN1 ក្នុងការផ្តល់សញ្ញា interferon ។
ដោយសារហ្សែន HLA មានពហុម៉ូហ្វីកខ្ពស់ យើងបានស្រង់ចេញលំដាប់លំដោយអានការគូសផែនទី HLA-A, -B, និង -C ពីទិន្នន័យលំដាប់ RNA នៃកោសិកា Flo-1 (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ។លំដាប់ Peptide ស្របជាមួយនឹងការអានតាមលំដាប់លំដោយបានបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាយ៉ាងសំខាន់រវាង HLA-A, -B, និង -C នៅក្នុងតំបន់ដែល peptides ឆ្លងគ្នាមានទីតាំងនៅ HLA-A (រូបភាព S3) ។លើសពីនេះទៀត យើងមិនបានសង្កេតមើលការភ្ជាប់គ្នារវាងប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីននៃម៉ូលេគុល HLA-B/C ជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីន H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 នោះទេ។នេះបង្ហាញថាអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនដែលរកឃើញរវាង HLA-A, MDN1, LRCH1 និង HMGA1 គឺជាក់លាក់ HLA-A ។លើសពីនេះទៀត ការវិភាគ proteomic នៃគំរូដែលមិនឆ្លង (តារាង S4) បានបង្ហាញថា HLA-A មានការគ្របដណ្តប់លំដាប់ខ្ពស់ជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹង HLA-B ឬ HLA-C ។peptides ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណសម្រាប់ HLA-A មានអាំងតង់ស៊ីតេខ្ពស់ទាំងក្នុង IFNα ដែលត្រូវបានព្យាបាល និងសំណាកដែលមិនព្យាបាល។
ដើម្បីធានាថាអន្តរកម្មដែលបានកំណត់នៅទីនេះមិនមែនដោយសារតែការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងមិនជាក់លាក់នៃប្រូតេអ៊ីនពីរនៅក្នុងទីតាំងជិតស្និទ្ធនោះទេ យើងបានបញ្ជាក់បន្ថែមទៀតនូវកត្តាអន្តរកម្ម HLA-A ថ្មីពីរដោយអនុវត្តការវិភាគរួមគ្នា immunoprecipitation ។អន្តរកម្ម HLA-A ជាមួយ MDN1 និង H2B ដែលគ្មានជាតិគីមីត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងកោសិកា Flo-1 ដែលត្រូវបានព្យាបាល និង IFNα ដែលមិនបានព្យាបាល (រូបភាព 7, រូបភាព S4) ។យើងបានបញ្ជាក់ថា HLA-A ត្រូវបានចាប់យកដោយ H2B នៅក្នុង immunoprecipitates ហើយថាការផ្សារភ្ជាប់នេះគឺដោយសារតែការព្យាបាល IFNα ចាប់តាំងពី HLA-A គឺអវត្តមាននៅក្នុងគំរូ immunoprecipitate ពីកោសិកាដែលមិនបានព្យាបាល (រូបភាព 7A) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទិន្នន័យរបស់យើងណែនាំថា IFNα ធ្វើនិយតកម្មដោយឌីផេរ៉ង់ស្យែលការភ្ជាប់ HLA-A ទៅ H2B និង MDN1 ។IFNα ជំរុញឱ្យមានទំនាក់ទំនងរវាង H2B និង HLA-A ប៉ុន្តែកាត់បន្ថយការផ្សារភ្ជាប់របស់វាជាមួយ MDN1 ។យើងបានរកឃើញថា MDN1 ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង HLA-A នៅក្នុងការគ្រប់គ្រង ហើយការបន្ថែមនៃ IFNα បានកាត់បន្ថយអន្តរកម្មនេះដោយឯករាជ្យពីការបញ្ចូល MDN1 ដោយ IFNα (រូបភាព 7B, C) ។លើសពីនេះទៀត HLA-A immunoprecipitation បានចាប់យក H2B នៅក្នុងកោសិកា A549 (រូបភាព S4) ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មនេះគឺឯករាជ្យនៃប្រភេទកោសិកា។សរុបមក លទ្ធផលទាំងនេះគាំទ្រអន្តរកម្មអន្តរកម្ម interferon នៃ HLA-A ជាមួយ H2B និង MDN1។
HLA-A សហការបន្សុទ្ធ H2B និង MDN1។ភ្នាក់ងារ immunoblots endogenous H2B (A) និង MDN1 (B) ត្រូវបាន immunoprecipitated ពីកោសិកា Flo-1 ដែលព្យាបាលដោយ IFNα និងត្រូវបានស៊ើបអង្កេតសម្រាប់អង្គបដិប្រាណដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។កណ្តុរ និងទន្សាយ IgG ត្រូវបានគេប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។(គ) បរិមាណដែលទាក់ទង (ការបញ្ចូល) នៃអង្គបដិប្រាណផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានបង្ហាញដោយ immunoblots ដែលត្រូវបានស៊ើបអង្កេតប្រឆាំងនឹងអង្គបដិប្រាណដែលបានបង្ហាញ β-actin ត្រូវបានគេប្រើជាឧបករណ៍គ្រប់គ្រងការផ្ទុក។
លក្ខណៈសម្បត្តិរចនាសម្ព័ន្ធនៃបណ្តាញទំនាក់ទំនងឆ្លងកាត់ដែលអាចទុកចិត្តបានខ្ពស់ដែលបង្កឡើងដោយ interferon គឺ H2B-HLA-A-HMGA1 ត្រូវបានស៊ើបអង្កេត។យើងបានប្រើការធ្វើគំរូឌីណាមិកម៉ូលេគុលជាវិធីសាស្រ្តជំនួសដើម្បីស្វែងយល់ពីសក្ដានុពលនៃទម្រង់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងស្មុគស្មាញនេះ (រូបភាពទី 8) ។ការសន្និដ្ឋានពីទិន្នន័យ CLMS បង្ហាញពីលទ្ធភាពនៃការអនុលោមភាពផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A និង HMGA1 ។ដូច្នេះ ស្មុគ្រស្មាញដែលមានសក្តានុពលខាងក្រោមត្រូវបានយកគំរូតាមឧបករណ៍ផ្ទុកសារធាតុរំលាយ៖ H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A និង H2B-HLA-A-HMGA1 ។អេក្រង់ចតប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនដំបូងដោយប្រើកញ្ចប់ MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) បានស្នើឱ្យមានការអនុលោមតាមដែលអាចកើតមានដែលខុសគ្នារវាងប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះ (រូបភាព 8A)។ការមើលឃើញនៃស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនចតបានបង្ហាញពីអន្តរកម្មជាច្រើន និងការអនុលោមតាមដែលអាចកើតមាន (រូបភាព 5A, 8) ។ដូច្នេះការអនុលោមតាមដែលអាចកើតមានត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងរូបភាពទី 8A (ជាមួយតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ដែលមានស្លាក) ហើយវាត្រូវបានវាយតម្លៃបន្ថែមទៀតដោយប្រើបំពង់គំរូ MD ។លើសពីនេះ ការចង H2B ឬ HMGA1 ទៅ HLA-A បញ្ជាក់ពីភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់នៃ H2B សម្រាប់ HLA-A (រូបភាព 8A)។
អនុលោមភាពនៃបណ្តាញដែលអាចកើតមានរវាង H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A និង H2B-HLA-A-HMGA1 ស្មុគស្មាញ។(ក) បន្ទះខាងឆ្វេងគឺជាផែនទី 2D (បង្កើតក្នុងកម្មវិធី SIM-XL) នៃតំណភ្ជាប់អន្តរម៉ូលេគុល (ក្រហម) និងអន្តរម៉ូលេគុល (ពណ៌ខៀវ) (ការកាត់ផ្តាច់តំណភ្ជាប់ទៅ 3.5)។លើសពីនេះ សំណល់តំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ដែលត្រូវបានកំណត់ត្រូវបានដាក់ស្លាកនៅលើរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីន H2B, HLA-A និង HMGA1។ការអនុលោមភាពដែលពាក់ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះត្រូវបានស្រង់ចេញដោយប្រើបំពង់ចូលចតដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងកញ្ចប់ MOE ។បន្ទះខាងឆ្វេងខាងក្រោមបង្ហាញពីការអនុលោមភាពដែលអាចកើតមានផ្សេងៗគ្នានៃស្មុគស្មាញ H2B-HLA-A និង HMGA1-HLA-A ដែលមានទំនាក់ទំនងរវាងប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នា (GBVI/WSA dG; kcal/mol) ។(ខ) គម្លាតស្តង់ដារ (RMSD) នៃទីតាំងអាតូមិក (មិនរាប់បញ្ចូលអាតូមអ៊ីដ្រូសែន) សម្រាប់រចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ។(C) អន្តរកម្មអន្តរកម្មចំណងអ៊ីដ្រូសែនប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនអន្តរម៉ូលេគុលពីស្មុគស្មាញក្លែងធ្វើផ្សេងៗដោយពិចារណាលើអន្តរកម្មជាក់លាក់នៃរយៈពេល≥ 10 ns ។ចម្ងាយកាត់អ្នកទទួល-សញ្ញាប័ណ្ណ h ត្រូវបានកំណត់ទៅ 3.5 Å ហើយមុំកាត់អ្នកទទួល-H-ទទួលត្រូវបានកំណត់ទៅ≥ 160°–180°។(ឃ) សំណល់ដែលមានស្លាកបង្កើតអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន HLA-A ជាមួយដៃគូរៀងៗខ្លួន ដែលលាតសន្ធឹង ≥ 20 ns ដកស្រង់ចេញពី dummy HLA-A-H2B និង HLA-A-HMGA1 complexes ។រចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនតំណាងឱ្យរចនាសម្ព័ន្ធជាមធ្យមនៃ 100 ns MDS ។(ង) អន្តរកម្មរវាងស្មុគស្មាញ HLA-A-H2B និង HLA-A-HMGA1 បើប្រៀបធៀបទៅនឹងអន្តរកម្មដែលត្រូវបានតាមដានដោយការក្លែងធ្វើ H2B-HLA លើសពី 100 ns ដោយផ្អែកលើគេហទំព័រអន្តរកម្ម K ឬ S រវាង peptides ទាំងពីរ។ស្មុគស្មាញ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1 ។តម្លៃកម្រិតសម្រាប់ការវាយតម្លៃនៃតំណភ្ជាប់ឆ្លងត្រូវបានកំណត់ទៅ 3.0 ហើយអន្តរកម្មជាក់លាក់ពី MDS ដែលទទួលយក≥ 10 ns ត្រូវបានយកមកពិចារណា។រចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគេមើលឃើញដោយប្រើប្រាស់ BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) និង Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ។
ស្ថេរភាពនៃម៉ូលេគុល HLA-A តាមពេលវេលា (គម្លាតស្តង់ដារ; RMSD ឬគម្លាតស្តង់ដារ; RMSF) បានបង្ហាញថាវត្តមាននៃប្រូតេអ៊ីន H2B ឬ HMGA1 នៅក្នុងស្មុគស្មាញបានធ្វើឱ្យមានស្ថេរភាព HLA-A (រូបភាព 8B, រូបភាព S5) ។ប្រូតេអ៊ីន HMGA1 ភ្ជាប់យ៉ាងតឹងរឹងទៅនឹងទីតាំង B2M នៃ HLA-A ដែលជំរុញឱ្យមានស្ថេរភាពនៃអាស៊ីតអាមីណូ HLA-A នៅក្នុងស្មុគស្មាញ HLA-A-HMGA1 ឬ H2B-HLA-A-HMGA1 (រូបភាព 8B, រូបភាព S5) ។ជាពិសេស សំណល់ HLA ~60-90 និង ~180-210 ត្រូវបានរកឃើញថាមានភាពបត់បែនតិចជាងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ H2B (រូបភព 8B)។H2B និង HMGA1 បានបង្ហាញពីការចងបានប្រសើរជាងមុនទៅនឹង HLA-A នៅក្នុងស្មុគស្មាញ H2B-HLA-A-HMGA1 បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការចង HLA-A ទៅ H2B ឬ HMGA1 តែឯង (រូបភាព 8C, D; តារាង S5) ។សំណល់ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការភ្ជាប់អ៊ីដ្រូសែន (MD បានយកគំរូតាមការកាន់កាប់ខ្ពស់≥ 10 ns) ស្របគ្នានឹងកន្លែងអន្តរកម្ម CLMS (សំណល់ K ឬ S) នៅក្នុងស្មុគស្មាញ ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មដែលកំណត់ដោយ CLMS គឺអាចទុកចិត្តបាន។ភាពជឿជាក់ (រូបភាព 8E) ។នៅក្នុងការធ្វើគំរូ CLMS និង MD សំណល់ HLA-A រវាងប្រហែល 190-210 និងអាស៊ីតអាមីណូប្រហែល 200-220 ត្រូវបានរកឃើញដើម្បីចង H2B និង HMGA1 រៀងគ្នា (រូបភាព 8E) ។
អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនបង្កើតជាបណ្តាញរចនាសម្ព័ន្ធថាមវន្តដែលសម្របសម្រួលទំនាក់ទំនងក្នុងកោសិកាក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចជាក់លាក់។ដោយសារតែវិធីសាស្រ្ត proteomics ជាច្រើនរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងកម្រិតស្ថិរភាពទាំងមូលនៃប្រូតេអ៊ីន សក្ដានុពលអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនត្រូវការឧបករណ៍បន្ថែមដើម្បីចាប់យកចំណុចប្រទាក់ចង ហើយ CLMS គឺជាឧបករណ៍មួយបែបនេះ។ប្រព័ន្ធផ្តល់សញ្ញា interferon គឺជាបណ្តាញ cytokine ដែលអនុញ្ញាតឱ្យកោសិកាឆ្លើយតបទៅនឹងជួរនៃសញ្ញាបង្កជំងឺបរិស្ថាន និងសញ្ញារោគវិទ្យាខាងក្នុង ដែលឈានដល់ការបញ្ចូលនូវបណ្តុំនៃប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible ។យើងបានអនុវត្ត CLMS ដើម្បីកំណត់ថាតើអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីនប្រលោមលោកអាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណក្នុងចំណោមបន្ទះនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបណ្តាលមកពី interferon ដែរឬទេ។ការវិភាគការភ្ជាប់ប្រូតេអ៊ីនសកលនៅក្នុងគំរូកោសិកា Flo-1 ដែលឆ្លើយតប interferon ត្រូវបានប្រើដើម្បីចាប់យកស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន។ការស្រង់ចេញនៃ tryptic peptides ពីកោសិកាដែលមិនមានតំណភ្ជាប់ឆ្លង និងឆ្លងគ្នាអនុញ្ញាតឱ្យមានការរាប់ peptide ការពង្រឹងផ្លូវ និងការចែកចាយប្រវែង peptide ជាមួយនឹងអាំងតង់ស៊ីតេ LFQ ដែលបានកំណត់។ប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible Canonical ត្រូវបានកំណត់ថាជាការត្រួតពិនិត្យផ្ទៃក្នុងវិជ្ជមាន ខណៈពេលដែលការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងអន្តរម៉ូលេគុលថ្មី និងអន្តរម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន interferon-inducible របស់ Canonical ដូចជា MX1, UP18, OAS3 និង STAT1 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ។លក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធផ្សេងៗ និងអន្តរកម្មនៅក្នុងតំបន់មុខងារត្រូវបានស៊ើបអង្កេត។
អន្តរកម្មរវាង HLA-A, MDN1 និង H2B ត្រូវបានរកឃើញដោយ immunoblotting នៅក្នុងកោសិកា Flo-1 និង A549 ដែលត្រូវបានព្យាបាល និងមិនបានព្យាបាលដោយ IFNα។លទ្ធផលរបស់យើងបញ្ជាក់ថា HLA-A ស្មុគស្មាញជាមួយ H2B ក្នុងលក្ខណៈដែលពឹងផ្អែក IFNα។ការងាររបស់យើងតំណាងឱ្យផ្លូវដ៏គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយសម្រាប់ការរុករកបន្ថែមទៀតនៃការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មរួមគ្នានៃអគារទាំងពីរនេះ។វាក៏គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ផងដែរក្នុងការពង្រីកវិធីសាស្រ្ត CLMS ទៅកាន់បន្ទះនៃបន្ទាត់កោសិកាដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន interferon ដែលសម្របសម្រួលដោយឯករាជ្យប្រភេទកោសិកា។ជាចុងក្រោយ យើងបានប្រើការធ្វើគំរូ MD ជាវិធីសាស្រ្តជំនួសដើម្បីយល់ពីសក្ដានុពលនៃទម្រង់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងស្មុគស្មាញ H2BFS-HLA-A-HMGA1 ដែលតាមដានការពិភាក្សាឆ្លងអន្តរម៉ូលេគុល និងអន្តរម៉ូលេគុល។ការសន្និដ្ឋានពីទិន្នន័យ CLMS បង្ហាញពីលទ្ធភាពនៃការអនុលោមភាពផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន H2BFS, HLA-A និង HMGA1 ។ការអនុលោមភាពខុសៗគ្នាដែលអាចកើតមានរវាងស្មុគ្រស្មាញប្រូតេអ៊ីនចតទាំងនេះបានបង្ហាញពីអន្តរកម្មជាច្រើនដែលស្រដៀងទៅនឹងអ្វីដែលបានសង្កេតនៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យ CLMS ។ចំនុចខ្លាំងមួយនៃវិធីសាស្រ្តរបស់យើងគឺថាវាអនុញ្ញាតឱ្យកំណត់អត្តសញ្ញាណយ៉ាងងាយស្រួលនៃអន្តរកម្មហ្សែនប៉ូលីម័រហ្វីកខ្ពស់ដូចជា HLA ដូច្នេះវានឹងគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ក្នុងការសិក្សាអំពីអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់ HLA haplotype ដែលពិបាកសិក្សា។សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថា CLMS អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីកការយល់ដឹងរបស់យើងអំពីបណ្តាញបញ្ជូនសញ្ញាដែលបណ្ដាលមកពី interferon និងផ្តល់មូលដ្ឋានសម្រាប់សិក្សាប្រព័ន្ធអន្តរកោសិកាដែលស្មុគស្មាញបន្ថែមទៀតនៅក្នុងមីក្រូបរិស្ថាននៃដុំសាច់។
កោសិកា Flo-1 ត្រូវបានទទួលពី ATCC និងរក្សាទុកក្នុង DMEM (Gibco) បន្ថែមដោយ 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% សេរ៉ូម bovine ទារក (Gibco) និងរក្សាទុកនៅ 37 ° C និង 5% CO2 ។ការភ្ញាស់។កោសិកាត្រូវបានលូតលាស់ដល់កម្រិត 70-80% មុនពេលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα14 (ផលិតដោយរោងចក្រផលិតប្រូតេអ៊ីន Edinburgh)។សារធាតុគីមី និងសារធាតុប្រតិកម្មផ្សេងទៀតទាំងអស់ត្រូវបានទិញពី Sigma Aldrich លុះត្រាតែមានការកត់សម្គាល់ផ្សេងទៀត។
កោសិកា Flo-1 ត្រូវបានដាំដុះក្នុងចានអណ្តូងចំនួន 6 ហើយនៅថ្ងៃបន្ទាប់កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 10 ng/ml IFNα14 សម្រាប់រយៈពេល 24 ម៉ោង ដល់ប្រមាណ 80% ។កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតបីដងជាមួយនឹង PBS និងភ្ជាប់ជាមួយ DSS (Thermo Fisher Scientific) ដែលរៀបចំថ្មីៗ (រំលាយនៅក្នុង DMSO) ក្នុង PBS រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37°C. ដល់កំហាប់ចុងក្រោយនៃ 0.5 mM ។ប្រតិកម្មឆ្លងនៃ DSS ត្រូវបានជំនួសដោយ PBS ហើយ DSS ដែលនៅសល់ត្រូវបានពន្លត់ដោយបន្ថែម 20 mM Tris (pH 8.0) នៅក្នុង PBS រយៈពេល 15 នាទីនៅ 37 ° C ។កោសិកា​ត្រូវ​បាន​ប្រមូល​ដោយ​ការ​ខ្ចាត់ខ្ចាយ និង​ប្រមូល​នៅ​ក្នុង​បំពង់​ដែល​ចង​ទាប (Axygen)។
គ្រាប់កោសិកាត្រូវបាន lysed ជាមួយ 300 µl នៃ urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងការញ័រម្តងម្កាល។ជំហាន centrifugation ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 14,000 xg នៅ 8 ° C ។ច្របាច់ lysate រយៈពេល 10 នាទី ហើយផ្ទេរ supernatant ទៅបំពង់ថ្មី។ភាគល្អិតច្បាស់ដែលនៅសេសសល់ត្រូវបានរំលាយក្នុង 150 μl នៃសតិបណ្ដោះអាសន្នលីហ្សីទី 2 (2 M អ៊ុយ, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) សម្រាប់រយៈពេល 30 នាទី ឬច្រើនជាងនេះ រហូតដល់ទទួលបានដំណោះស្រាយ aqueous ដូចគ្នា។lysate ត្រូវបាន centrifuged រយៈពេល 20 នាទី ហើយ supernatant ត្រូវបានលាយជាមួយនឹង lysate ដែលទទួលបានក្នុងជំហានមុន។កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគេវាយតម្លៃដោយប្រើ Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិតសម្រាប់នីតិវិធីមីក្រូប្លាត។សំណាកត្រូវបានកកយ៉ាងលឿនក្នុងអាសូតរាវ ហើយរក្សាទុកនៅ -80°C។
ប្រហែល 100 μg នៃប្រូតេអ៊ីនឆ្លងកាត់តំណរលាយត្រូវបានដំណើរការដោយប្រើពិធីការការរៀបចំគំរូចម្រោះដែលបានកែប្រែ (FASP) ដូចដែលបានពិពណ៌នាដោយ Wisniewski et al ។69 ដោយសង្ខេប ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានភ្ជាប់ជាមួយ 200 μl នៃសតិបណ្ដោះអាសន្នអ៊ុយ (8 M អ៊ុយក្នុង 0.1 M Tris, pH 8.5) vortexed និងពាក់កណ្តាល។ជំហាន centrifugation ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 14,000 xg នៅ 25 ° C ។ពាក់កណ្តាលដំបូងនៃ lysate ប្រូតេអ៊ីនឆ្លងត្រូវបានផ្ទេរទៅឧបករណ៍ចម្រោះ 10 kDa Microcon centrifugal ដែលបំពាក់ដោយភ្នាស Ultracel-10 (Merck) បន្តដោយ centrifugation នៅលើតម្រងរយៈពេល 25 នាទី។បន្ទាប់មកបន្ថែមពាក់កណ្តាលទីពីរនៃប្រូតេអ៊ីនទៅក្នុងតម្រងហើយធ្វើម្តងទៀតនូវជំហានដូចគ្នា។ការស្ដារឡើងវិញនូវប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានអនុវត្តដោយបន្ថែម 100 μlនៃ 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) នៅក្នុងបណ្តុំអ៊ុយ។ការងើបឡើងវិញត្រូវបានកូរនៅលើម៉ាស៊ីនលាយកំដៅនៅ 600 rpm រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេ។លើសពីនេះ ជួរឈរត្រូវបាន centrifuged និងកាត់បន្ថយប្រូតេអ៊ីនឆ្លងកាត់តំណភ្ជាប់ត្រូវបាន alkylated ដោយប្រើ 100 μl នៃ 50 mM iodoacetamide នៅក្នុង urea buffer ។ប្រតិកម្មអាល់កាឡាំងត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 20 នាទីក្នុងទីងងឹត។បង្វិលជួរឈរ លាងជញ្ជាំងជួរឈរ 3 ដងជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្នអ៊ុយ 100 µl ហើយបន្ទាប់មក centrifuge ។ប្រតិបត្តិការដូចគ្នានេះត្រូវបានអនុវត្ត 3 ដងដោយប្រើ 100 μlនៃ 100 mM ammonium bicarbonate ។មុនពេល trypsinization ជំនួសបំពង់ប្រមូលដោយថ្មីមួយ។បន្ថែមសតិបណ្ដោះអាសន្នការរំលាយអាហារដែលមានផ្ទុក 50 mM ammonium bicarbonate និង 1 µl trypsin ពនឺក្នុង trypsin buffer (Promega) ។សមាមាត្រនៃ trypsin ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានរក្សានៅប្រហែល 1:33 ហើយប្រតិកម្មនៃការរំលាយអាហារត្រូវបាន incubed មួយយប់នៅ 37 ° C. នៅក្នុងបន្ទប់សើមមួយ។សារធាតុ peptide ឆ្លងត្រូវបានដកចេញពីតម្រងដោយ centrifugation រយៈពេល 25 នាទី។ការងើបឡើងវិញនៃ Peptide ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងដោយបន្ថែម 50 μlនៃ 0.5 M NaCl ទៅក្នុងតម្រង បន្ទាប់មកដោយ centrifugation រយៈពេល 25 នាទី។
C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) ត្រូវបានប្រើដើម្បីលុបបំបាត់សារធាតុ tryptic peptides ឆ្លងតំណភ្ជាប់តាមពិធីការដែលបានពិពណ៌នាដោយ Bouchal et al.70 ជាមួយនឹងការកែប្រែតិចតួច។ដោយសង្ខេប ជួរឈរបង្វិល C18 ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មជាមួយនឹងការលាងចំនួនបីនៃ 0.1% អាស៊ីត formic (FA) នៅក្នុង acetonitrile (AcN) (Merck) និងការលាងចំនួន 2 នៃ 0.1% FA ។ជួរឈរត្រូវបានផ្តល់ជាតិទឹកជាមួយនឹង 0.1% FA សម្រាប់រយៈពេល 15 នាទី។ផ្ទុកសំណាកទៅក្នុងជួរឈរបង្វិល ហើយលាងសម្អាត 3 ដងជាមួយនឹង 0.1% FA ។peptides ដែលត្រូវបានលុបចោលត្រូវបានដកចេញជាបន្តបន្ទាប់ជាមួយនឹងជម្រាលជាជំហានៗដោយប្រើ 50%, 80% និង 100% AcN ក្នុង 0.1% FA ។សំណាកត្រូវបានសម្ងួតនៅក្នុងម៉ាស៊ីនប្រមូលផ្តុំ SpeedVac Plus (Eppendorf) រហូតដល់វត្ថុរាវដែលនៅសល់បានបាត់ទាំងស្រុង។សារធាតុ peptides ត្រូវបានរំលាយក្នុង 100 μl នៃ 0.08% trifluoroacetic acid ក្នុង 2.5% AcN ហើយការប្រមូលផ្តុំត្រូវបានវាស់នៅលើ NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)។ប្រហែល 1 μg នៃ peptide crosslinked ក្នុងមួយគំរូត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងប្រព័ន្ធ LC-MS/MS ។
សារធាតុ peptides ឆ្លងត្រូវបានបំបែកនៅលើប្រព័ន្ធ UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ម៉ាស់ Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) ។សារធាតុ peptides ឆ្លងត្រូវបានប្រមូលនៅលើលេខសម្គាល់ 300 µm, 5 mm ប្រវែង µ-pre-column C18 capture column packed with C18 PepMap100 sorbent និង 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ។ផ្ទុកលំហូរបូមដែលបានកំណត់នៅ 5 µl / នាទី 0.08% អាស៊ីត trifluoroacetic រំលាយក្នុង 2.5% AcN ។សារធាតុ peptides ឆ្លងត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរស៊ីលីកាដែលផ្សំដោយការវិភាគដែលមានអង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 75 μm និងប្រវែង 150 mm ពោរពេញទៅដោយសារធាតុ PepMap sorbent 2 μm (Thermo Scientific)។ដំណាក់កាលចល័ត A និង B មាន 0.1% FA នៅក្នុងទឹក និង 0.1% FA នៅក្នុង acetonitrile រៀងគ្នា។ជម្រាលចាប់ផ្តើមនៅ 2.5% B និងកើនឡើងជាលីនេអ៊ែរទៅ 40% B ក្នុងរយៈពេល 90 នាទី បន្ទាប់មកទៅ 90% B ក្នុងរយៈពេល 2 នាទីបន្ទាប់។សមាសភាពដំណាក់កាលចល័តត្រូវបានរក្សានៅ 90% B សម្រាប់រយៈពេល 10 នាទី ហើយបន្ទាប់មកថយចុះជាលីនេអ៊ែរទៅ 2.5% B ក្នុងរយៈពេល 2 នាទី។ជួរឈរត្រូវបានស្មើគ្នានៅ 2.5% B សម្រាប់រយៈពេល 8 នាទីមុនពេលវដ្តបន្ទាប់។សារធាតុ peptides ឆ្លងដែលត្រូវបានដកចេញពីជួរឈរវិភាគត្រូវបាន ionized នៅក្នុងប្រភព nanoelectrospray ionization (NSI) ហើយបានចាក់ចូលទៅក្នុង Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific)។
ឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ម៉ាស់ Orbitrap Exploris 480 ដំណើរការក្នុងរបៀបទំនាក់ទំនងទិន្នន័យវិជ្ជមាន។ការស្កេនពេញលេញត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងរបៀបផ្នែកនៅកម្រិតភាពច្បាស់ 120,000 ជាមួយនឹងការកំណត់ជួរចាប់ពី m/z 350 Th ដល់ m/z 2000 Th ។គោលដៅ AGC ធម្មតាត្រូវបានកំណត់នៅ 300% ជាមួយនឹងពេលវេលាបញ្ចូលអតិបរមា 50ms ។ការរកឃើញកំពូល Monoisotopic ត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រាប់ peptides ។ប៉ារ៉ាម៉ែត្របន្ធូរបន្ថយកំហិតត្រូវបានកំណត់ទៅពិត ប្រសិនបើរកឃើញមុនគេតិចពេក។កម្លាំងអ៊ីយ៉ុងអប្បរមានៃនៃមុនគេត្រូវបានកំណត់ទៅ 5.0e3 ហើយស្ថានភាពបន្ទុកមុនគេរហូតដល់ +8 ត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងការពិសោធន៍។
ពេលវេលាវដ្ដរវាងការស្កេនសំខាន់ៗនៅក្នុងរបៀបទំនាក់ទំនងទិន្នន័យត្រូវបានកំណត់ទៅ 2.5 វិនាទី។ការដកម៉ាស់ថាមវន្តត្រូវបានកំណត់ទៅ 20 វិនាទីបន្ទាប់ពីការបំបែកដំបូងនៃអ៊ីយ៉ុងមុនគេ។បង្អួច​ភាព​ឯកោ​មុន​គេ​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ទៅ 2 Th ។ប្រភេទនៃថាមពលប៉ះទង្គិចធម្មតាជាមួយនឹងរបៀបថាមពលប៉ះទង្គិចថេរត្រូវបានជ្រើសរើសនៅក្នុងការស្កេន MS/MS អាស្រ័យលើទិន្នន័យ។ថាមពលប៉ះទង្គិចកំណត់ទៅ 30% ។ដំណោះស្រាយ Orbitrap ត្រូវបានកំណត់ទៅ 15,000 ហើយគោលដៅ AGC ដល់ 100% ។ពេលវេលាចាក់អតិបរមាផ្ទាល់ខ្លួនត្រូវបានកំណត់ទៅ 60 មិល្លីវិនាទី។
មុនពេលតាមដានបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងសំណាកដែលភ្ជាប់គ្នា យើងបានដំណើរការឯកសារឆៅដោយប្រើកញ្ចប់ MaxQuant (កំណែ 1.6.12.0)26,27 ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ peptides/proteins ដែលអាចតាមដានបាននៅក្នុងគំរូ។លើសពីនេះ ការវិភាគប្រូតេអ៊ីមស្រដៀងគ្នាត្រូវបានអនុវត្តលើសំណាក Flo-1 ដែលមិនភ្ជាប់គ្នាដែលត្រូវបានព្យាបាល និងមិនត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα។ទិន្នន័យ MS/MS ត្រូវបានស្វែងរកនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យមនុស្ស UniProt (www.uniprot.org) (បានបង្ហោះនៅថ្ងៃទី 12 ខែសីហា ឆ្នាំ 2020 មានធាតុ 75,093) ដោយប្រើម៉ាស៊ីនស្វែងរក Andromeda27 ដែលភ្ជាប់មកជាមួយ។ការស្វែងរកត្រូវបានអនុវត្តដោយមិនបង្ហាញពីភាពជាក់លាក់នៃអង់ស៊ីម និងការកែប្រែផ្សេងៗនៃ deamidation (N, Q) និង oxidation (M) ។ការអត់ធ្មត់ម៉ាស់មុនត្រូវបានកំណត់នៅ 20 ppm និងអ៊ីយ៉ុងផលិតផលនៅ 0.02 Da ។គម្លាតម៉ាស់ដំបូង និងអតិបរមាត្រូវបានកំណត់ទៅ 10 ppm ។ម៉ាស់អតិបរិមានៃ peptide ត្រូវបានកំណត់នៅ 4600 Da ហើយភាពស្រដៀងគ្នានៃលំដាប់ត្រូវបានកំណត់រវាងអាស៊ីតអាមីណូ 7 និង 25 (aa) ។ការវិភាគស្ថិតិបន្ថែមត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី Perseus (កំណែ 1.6.10.45) ។មាតិកាប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគណនាដោយការធ្វើឱ្យធម្មតានៃអាំងតង់ស៊ីតេនៃប្រូតេអ៊ីន (LFQ អាំងតង់ស៊ីតេ; បរិមាណដែលមិនមានស្លាក) 27 ហើយតម្លៃអាំងតង់ស៊ីតេត្រូវបានបំលែងទៅជា Log2 ។បណ្តុំប្រូតេអ៊ីនតាមឋានានុក្រមដែលកំណត់ដោយអាំងតង់ស៊ីតេ peptide របស់វាត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើកញ្ចប់ phheatmap (v1.0.12) ក្នុង R (v 4.1.2) ។ការវិភាគការពង្រឹងផ្លូវត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យផ្លូវ Reactome សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មច្រើនជាង 4 ដងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងគំរូដែលមិនបានព្យាបាល។
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណតំណភ្ជាប់គីមីជាក់លាក់នៃលីស៊ីន (K) ឬសេរិន (S) នៃសមាសធាតុប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយ LC-MS/MS ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើម៉ាស៊ីនកំណត់អត្តសញ្ញាណ spectroscopic (SIM-XL) សម្រាប់ peptides ឆ្លង (SIM-XL)29 ។ទីមួយ អន្តរកម្មដែលអាចកើតមានរវាងហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងការបំផ្លាញ DNA (IFN) របស់ interferon (IRDS) ត្រូវបានស៊ើបអង្កេតដោយប្រើសំណុំទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីន IRDS ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង Padariya et al.28 ។ការពិនិត្យមើលគ្រប់លក្ខខណ្ឌ និងការកើតឡើងម្តងទៀតនៃ UniProt របស់មនុស្សទាំងមូលគឺពឹងផ្អែកខ្លាំងលើការគណនា ដូច្នេះមូលដ្ឋានទិន្នន័យ UniProt របស់មនុស្សទាំងមូល (www.uniprot.org) (បានទាញយកនៅថ្ងៃទី 12 ខែសីហា ឆ្នាំ 2020 មានធាតុ 75,093) ប្រឆាំងនឹងការកើតឡើងម្តងទៀតដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ IFNα។តម្រងមួយក្នុងចំណោមតម្រងសម្រាប់អន្តរកម្មភាពជឿជាក់ខ្ពស់។អន្តរកម្មដែលមានសារៈសំខាន់ខ្ពស់ទាំងនេះដែលទទួលបានត្រូវបានពង្រីក និងសាកល្បងនៅក្នុងពាក្យដដែលៗ និងលក្ខខណ្ឌទាំងអស់។
នៅក្នុង SIM-XL DSS ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ crosslinker (XL) ហើយការផ្លាស់ប្តូរទម្ងន់ XL និងការកែប្រែទម្ងន់ត្រូវបានកំណត់ទៅ 138.06 និង 156.07 រៀងគ្នា។គេហទំព័រប្រតិកម្មឆ្លងតំណភ្ជាប់ខាងក្រោមត្រូវបានពិចារណា៖ KK, KS និង KN-TERM ដោយគ្មានអ៊ីយ៉ុងអ្នកយកព័ត៌មាន។ទាំង precursor និង fragment ppm ត្រូវបានកំណត់ទៅ 20 ហើយកម្រិត Xrea ត្រូវបានកំណត់ទៅ 0.15 ។Trypsin ត្រូវបានចាត់ទុកថាមានលក្ខណៈជាក់លាក់ទាំងស្រុង ហើយវិធីសាស្ត្របំបែក C-trap (HCD) ថាមពលខ្ពស់ត្រូវបានអនុវត្ត។កម្រិតកាត់បន្ថយ DB ថាមវន្ត XCorr និងចំនួនអប្បបរមានៃ peptides សម្រាប់ការកាត់បន្ថយ DB ថាមវន្តត្រូវបានកំណត់ទៅ 2.5 និង 2 រៀងគ្នា។ប៉ារ៉ាម៉ែត្រផ្សេងទៀតគឺ៖ ប្រូបាប៊ីលីតេ monoisotope និងការកាត់ផ្តាច់ចៃដន្យកំពូល សំណល់ AA អប្បបរមា 4 ក្នុងមួយខ្សែ និងការគិតថ្លៃខ្សែអតិបរមា និង 3 អតិបរមានៃការបំបែកដែលខកខាន។លទ្ធផលផែនទី 2D ដែលបានដេរភ្ជាប់ត្រូវបានវិភាគជា (SIM-XL) ហើយតំណាងក្រាហ្វិក xQuest28 ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតផែនទី 2D ។តំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ប្រូតេអ៊ីននៅលើរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានផ្តល់ជូននៅក្នុង PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC)។
រចនាសម្ព័ន្ធគំរូប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើម៉ាស៊ីនមេ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ដោយប្រើគោលការណ៍នៃគំរូគំរូដូចគ្នា និងការអនុវត្តនៃ "Hidden Markov Method" ។Phyre2 បង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធគំរូដោយផ្អែកលើការតម្រឹមតាមលំដាប់ជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនដែលគេស្គាល់។សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, និង MDN1 រចនាសម្ព័ន្ធគំរូ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, និង 6i2665 ត្រូវបានប្រើប្រាស់។លើសពីនេះទៀតរចនាសម្ព័ន្ធរបស់ AlphaFold71 MX1, UBP18 និង ROBO1 ក៏ត្រូវបានពិចារណាផងដែរ។រចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគេមើលឃើញដោយប្រើកញ្ចប់ BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) និងកញ្ចប់បរិស្ថានប្រតិបត្តិការម៉ូលេគុល (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ។