347 12.7 * 1.24mm បំពង់ដែកអ៊ីណុក , យន្តការម៉ូលេគុលនៃ condensation អេឡិចត្រូស្ទិកធ្វើសមកាលកម្ម និងការ coaggregation នៃ α-synuclein និង tau

សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
គ្រាប់រំកិលបង្ហាញអត្ថបទបីក្នុងមួយស្លាយ។ប្រើប៊ូតុងខាងក្រោយ និងបន្ទាប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយ ឬប៊ូតុងឧបករណ៍បញ្ជាស្លាយនៅចុងបញ្ចប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយនីមួយៗ។

347 ភាពជាក់លាក់នៃបំពង់ដែកអ៊ីណុក

347 12.7*1.24mm បំពង់ដែកអ៊ីណុក

អង្កត់ផ្ចិតខាងក្រៅ៖ 6.00 mm OD រហូតដល់ 914.4 mm OD, Size រហូតដល់ 24” NB available Ex-stock, OD Size Steel Tubes available Ex-stock

ជួរកម្រាស់បំពង់ SS 347: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ល (0.5-12mm) ឬទំហំមិនទៀងទាត់ដែលត្រូវកែសម្រួលតាមតម្រូវការ

ប្រភេទ៖ SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW បំពង់ |SS 347 Welded Pipes |SS 347 បំពង់ប្រឌិត |បំពង់ SS 347 CDW, បំពង់ LSAW / Seam-welded / Redrawn

ទម្រង់៖ បំពង់/បំពង់មូល SS 347, បំពង់/បំពង់ការ៉េ SS 347, បំពង់រាងចតុកោណ SS 347, បំពង់រាងមូល SS 347, ទម្រង់ SS 347 “U”, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

ប្រវែង៖ ចៃដន្យតែមួយ, ចៃដន្យទ្វេ និងប្រវែងដែលត្រូវការ៖ ចុងធម្មតា, ចុងបត់, ជាន់

ការការពារចុង៖ មួកប្លាស្ទិក |ការបញ្ចប់ខាងក្រៅ: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish សម្រាប់បំពង់ដែកអ៊ីណុក បញ្ចប់តាមតម្រូវការរបស់អតិថិជន

លក្ខខណ្ឌនៃការដឹកជញ្ជូន៖ លាបរួច ប៉ូលា រលោង ភ្លឺ គូរត្រជាក់

ការត្រួតពិនិត្យ របាយការណ៍សាកល្បង៖ វិញ្ញាបនបត្រតេស្ត Mill, EN 10204 3.1, របាយការណ៍គីមី, របាយការណ៍មេកានិច, របាយការណ៍តេស្ត PMI, របាយការណ៍ត្រួតពិនិត្យដែលមើលឃើញ, របាយការណ៍អធិការកិច្ចភាគីទីបី, របាយការណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ដែលបានអនុម័ត NABL, របាយការណ៍តេស្តបំផ្លិចបំផ្លាញ, របាយការណ៍តេស្តដែលមិនបំផ្លិចបំផ្លាញ

ការវេចខ្ចប់៖ ខ្ចប់ក្នុងប្រអប់ឈើ ថង់ផ្លាស្ទិច បន្ទះដែកដែលខ្ចប់ខ្ចប់ ឬតាមការស្នើសុំរបស់អតិថិជន

ពិសេស៖ ទំហំ និងភាពជាក់លាក់ក្រៅពីខាងលើអាចផលិតតាមការស្នើសុំ

ជួរទំហំបំពង់ SS 347: 1/2 អ៊ីញ NB, OD ដល់ 24 អ៊ីញ

ASTM A312 347: បំពង់ austenitic welded គ្មានថ្នេរនិងត្រង់ដែលមានបំណងសម្រាប់សីតុណ្ហភាពខ្ពស់និងសេវា corrosive ទូទៅ។លោហៈធាតុបំពេញមិនត្រូវបានអនុញ្ញាតក្នុងអំឡុងពេលផ្សារ។

ASTM A358 347: អេឡិចត្រូត welded បំពង់ austenitic សម្រាប់ corrosive និង / ឬសេវាសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។ជាធម្មតាមានតែបំពង់រហូតដល់ 8 អ៊ីញប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានផលិតតាមលក្ខណៈបច្ចេកទេសនេះ។ការបន្ថែមលោហៈធាតុបំពេញត្រូវបានអនុញ្ញាតក្នុងអំឡុងពេលផ្សារ។

ASTM A790 347: បំពង់ ferritic/austenitic (duplex) welded ដោយគ្មានថ្នេរ និងជាប់គ្នា ដែលមានបំណងសម្រាប់សេវា corrosive ទូទៅ ដោយមានការសង្កត់ធ្ងន់ពិសេសលើភាពធន់ទ្រាំទៅនឹងការបង្ក្រាបការ corrosion ភាពតានតឹង។

ASTM A409 347: ប្រសព្វអគ្គិសនីនៃថ្នេរត្រង់ ឬតំរៀបស្លឹក welded អង្កត់ផ្ចិតធំ បំពង់ជញ្ជាំងពន្លឺ austenitic ក្នុងទំហំ 14 "ទៅ 30" ជាមួយនឹងជញ្ជាំង Sch5S និង Sch 10S សម្រាប់ corrosive និង / ឬខ្ពស់

ASTM A376 347: បំពង់ austenitic គ្មានថ្នេរសម្រាប់កម្មវិធីសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។

ASTM A813 347: បំពង់ austenitic ផ្សារតែមួយ ថ្នេរតែមួយ ឬពីរដង សម្រាប់សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ និងកម្មវិធីច្រេះទូទៅ។

ASTM A814 347: បំពង់ austenitic welded ដែលដំណើរការដោយត្រជាក់សម្រាប់សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ និងសេវាកម្មច្រេះទូទៅ។

សមាសធាតុគីមីនៃបំពង់ដែកអ៊ីណុក 347H

ដែកអ៊ីណុក 347H លក្ខណៈមេកានិចនៃបំពង់

ដែកអ៊ីណុក 347H បំពង់ លក្ខណៈសម្បត្តិរូបវន្ត

ថ្នាក់សមមូលសម្រាប់បំពង់ដែកអ៊ីណុក 347H

ការប្រមូលផ្តុំ Amyloid alpha-synuclein (αS) គឺជាសញ្ញាសម្គាល់នៃជំងឺផាកឃីនសុន និងជំងឺ synucleinopathies ផ្សេងទៀត។ថ្មីៗនេះ ប្រូតេអ៊ីន tau ដែលជាទូទៅត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងជំងឺ Alzheimer ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង αS pathology ហើយបានរកឃើញថាធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងការរួមបញ្ចូលដែលសំបូរទៅដោយ αS ទោះបីជាយន្តការម៉ូលេគុលនៃការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនៅតែមិនច្បាស់លាស់ក៏ដោយ។យើងរាយការណ៍នៅទីនេះថាដំណាក់កាល αS បំបែកទៅជា condensates រាវតាមរយៈ condensation ស្មុគ្រស្មាញ electrostatic ជាមួយនឹង polypeptides ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមានដូចជា tau ។អាស្រ័យលើភាពស្និទ្ធស្នាលនៃ αS សម្រាប់ polycations និងអត្រានៃការថយចុះនៃ valence នៃបណ្តាញ coagulation នោះកំណកឈាមឆ្លងកាត់ gelation យ៉ាងឆាប់រហ័ស ឬ coalescence អមដោយការប្រមូលផ្តុំ amyloid យឺត។ដោយរួមបញ្ចូលគ្នានូវឈុតនៃបច្ចេកទេសជីវរូបវិទ្យាកម្រិតខ្ពស់ យើងអាចកំណត់លក្ខណៈនៃការបំបែកដំណាក់កាល αS/Tau រាវ និងកំណត់កត្តាសំខាន់ៗដែលនាំទៅដល់ការបង្កើតសារធាតុចម្រុះដែលមានប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនៅក្នុង condensate ប្រូតេអ៊ីនរាវ។
បន្ថែមពីលើផ្នែកភ្នាស ការបំបែកលំហនៅក្នុងកោសិកាក៏អាចត្រូវបានសម្រេចដោយការបង្កើតអង្គធាតុរាវដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីន ដែលហៅថា condensates ឬដំណក់ទឹកជីវម៉ូលេគុល តាមរយៈដំណើរការដែលគេស្គាល់ថាការបំបែកដំណាក់កាលរាវ-រាវ (LLPS)។ដំណក់ទឹកទាំងនេះត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយអន្តរកម្មបណ្ដោះអាសន្នពហុមុខងារ ជាធម្មតារវាងប្រូតេអ៊ីន ឬប្រូតេអ៊ីន និង RNA និងបម្រើមុខងារជាច្រើននៅក្នុងប្រព័ន្ធរស់នៅស្ទើរតែទាំងអស់។មួយចំនួនធំនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានសមត្ថភាព LLP បង្ហាញពីលំដាប់នៃភាពស្មុគស្មាញទាប ដែលមានលក្ខណៈមិនប្រក្រតីខ្លាំងនៅក្នុងធម្មជាតិ និងនៅក្នុងការបង្កើត condensates ជីវម៉ូលេគុល3,4,5។ការសិក្សាពិសោធន៍ជាច្រើនបានបង្ហាញពីលក្ខណៈដែលអាចបត់បែនបាន ជារឿយៗមានភាពមិនប្រក្រតី និងច្រើននៃប្រូតេអ៊ីនដែលបង្កើតជា condensates ដូចរាវទាំងនេះ ទោះបីជាគេដឹងតិចតួចអំពីកត្តាកំណត់ម៉ូលេគុលជាក់លាក់ដែលគ្រប់គ្រងការលូតលាស់ និងកាលកំណត់នៃ condensates ទាំងនេះទៅជារឹងជាង។ រដ្ឋ។.
ទិន្នន័យថ្មីគាំទ្រការសន្មត់ថា LLPS ដែលជំរុញដោយប្រូតេអ៊ីនមិនប្រក្រតី និងការបំប្លែងដំណក់ទឹកទៅជារចនាសម្ព័ន្ធរឹងអាចជាផ្លូវកោសិកាដែលពាក់ព័ន្ធដែលនាំទៅដល់ការបង្កើតសារធាតុពុលដែលមិនអាចរលាយបាន ដែលជារឿយៗជាសញ្ញានៃជំងឺ degenerative ។ប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមានសណ្តាប់ធ្នាប់ខាងក្នុងដែលជាប់ទាក់ទង LLPS ជាច្រើន (IDPs) ដែលជារឿយៗមានការចោទប្រកាន់ខ្ពស់ និងអាចបត់បែនបានត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការថយចុះនៃសរសៃប្រសាទតាមរយៈដំណើរការនៃការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីត។ជាពិសេស ជីវម៉ូលេគុល IDP condensates ដូចជា FUS7 ឬ TDP-438 ឬប្រូតេអ៊ីនដែលមានដែនស្មុគស្មាញទាបដូចជា hnRNPA19 ត្រូវបានបង្ហាញដល់អាយុចូលទៅក្នុងទម្រង់ដូចជែល ឬសូម្បីតែទម្រង់រឹងតាមរយៈដំណើរការហៅថា fluidization ។សមាសធាតុ។ទៅជាការផ្លាស់ប្តូរដំណាក់កាលរឹង (LSPT) ជាមុខងារនៃពេលវេលា ឬជាការឆ្លើយតបទៅនឹងការកែប្រែក្រោយការបកប្រែជាក់លាក់ ឬការផ្លាស់ប្តូរដ៏សំខាន់ខាងរោគសាស្ត្រ1,7 ។
IDP មួយផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង LLPS នៅក្នុង vivo គឺ Tau ដែលជាប្រូតេអ៊ីនដែលមានជំងឺទាក់ទងនឹង microtubule ដែលការប្រមូលផ្តុំ amyloid ត្រូវបានជាប់ពាក់ព័ន្ធក្នុងជំងឺ Alzheimer's 10 ប៉ុន្តែថ្មីៗនេះក៏ត្រូវបានជាប់ពាក់ព័ន្ធនៅក្នុងជំងឺ Parkinson (PD) និង synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 ផ្សេងទៀត។Tau ត្រូវ​បាន​គេ​បង្ហាញ​ថា​បាន​ផ្តាច់​ចេញ​ដោយ​ឯកឯង​ពី​ដំណោះ​ស្រាយ/cytoplasm ដោយសារ​អន្តរកម្ម​អេឡិចត្រូស្តាត​ដែល​អំណោយផល​14 ដែល​ជា​លទ្ធផល​ក្នុង​ការ​បង្កើត​នូវ​ដំណក់ទឹក​ដែល​សំបូរ​ទៅដោយ​សារធាតុ​ tau ដែល​គេ​ស្គាល់​ថា​ជា coacervates អេឡិចត្រូត។វាត្រូវបានគេសង្កេតផងដែរថាប្រភេទនៃអន្តរកម្មមិនជាក់លាក់នេះគឺជាកម្លាំងជំរុញនៅពីក្រោយ condensates ជីវម៉ូលេគុលជាច្រើននៅក្នុងធម្មជាតិ15 ។ក្នុងករណីនៃប្រូតេអ៊ីន tau ការប្រមូលផ្តុំអេឡិចត្រូស្ទិកអាចត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការប្រមូលផ្តុំដ៏សាមញ្ញ ដែលក្នុងនោះតំបន់ដែលមានបន្ទុកផ្ទុយគ្នានៃប្រូតេអ៊ីនបង្កឱ្យមានដំណើរការបំបែក ឬដោយការប្រមូលផ្តុំស្មុគស្មាញតាមរយៈអន្តរកម្មជាមួយប៉ូលីម័រដែលមានបន្ទុកអវិជ្ជមានដូចជា RNA ។
ថ្មីៗនេះ α-synuclein (αS) ដែលជា amyloid IDP ដែលជាប់ពាក់ព័ន្ធនៅក្នុង PD និងជំងឺប្រព័ន្ធប្រសាទផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជា synucleinopathy17,18 ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងគំរូកោសិកា និងសត្វ19,20 ដែលប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន condensates ជាមួយនឹងអាកប្បកិរិយាដូចសារធាតុរាវ។ការសិក្សានៅក្នុង vitro បានបង្ហាញថា αS ឆ្លងកាត់ LLPS ដោយការប្រមូលផ្តុំសាមញ្ញតាមរយៈអន្តរកម្ម hydrophobic លើសលុប ទោះបីជាដំណើរការនេះតម្រូវឱ្យមានកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនខ្ពស់ពិសេស និងពេលវេលា incubation យូរ atypically 19,21 ។ថាតើ condensates ដែលមាន αS ដែលសង្កេតឃើញនៅក្នុង vivo ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយដំណើរការនេះ ឬដំណើរការ LLPS ផ្សេងទៀតនៅតែជាបញ្ហាសំខាន់ដែលមិនអាចដោះស្រាយបាន។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ទោះបីជាការប្រមូលផ្តុំ αS amyloid ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងកោសិកាប្រសាទក្នុង PD និង synucleinopathies ផ្សេងទៀតក៏ដោយ យន្តការពិតប្រាកដដែល αS ឆ្លងកាត់ការប្រមូលផ្តុំ amyloid intracellular នៅតែមិនច្បាស់លាស់ ព្រោះការហួសប្រមាណនៃប្រូតេអ៊ីននេះហាក់ដូចជាមិនបង្កឱ្យមានដំណើរការនេះដោយខ្លួនឯង។ការខូចខាតកោសិកាបន្ថែមគឺត្រូវបានទាមទារជាញឹកញាប់ ដែលបង្ហាញថាទីតាំងកោសិកាជាក់លាក់ ឬមីក្រូបរិស្ថានត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបង្កើតឡើងវិញនៃសន្និបាត αS amyloid intracellular ។បរិយាកាសកោសិកាមួយដែលងាយនឹងប្រមូលផ្តុំអាចជាផ្នែកខាងក្នុងនៃប្រូតេអ៊ីន condensates 23 ។
គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ αS និង tau ត្រូវបានគេរកឃើញថាធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងការរួមបញ្ចូលជំងឺលក្ខណៈនៅក្នុងមនុស្សដែលមានជំងឺផាកឃីនសុននិងជំងឺ synucleinopathies ផ្សេងទៀត 24,25 ហើយការពិសោធន៍បានរាយការណ៍ពីទំនាក់ទំនងរោគសាស្ត្រដែលរួមបញ្ចូលគ្នារវាងប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរ 26,27 ដែលបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងសក្តានុពលរវាងការប្រមូលផ្តុំ αS និង tau នៅក្នុងជំងឺ neurodegenerative ។ជំងឺ។αS និង tau ត្រូវបានគេរកឃើញដើម្បីធ្វើអន្តរកម្ម និងលើកកម្ពស់ការប្រមូលផ្តុំគ្នាទៅវិញទៅមកនៅក្នុង vitro និងនៅក្នុង vivo 28,29 ហើយការរួមផ្សំគ្នាដែលផ្សំឡើងដោយប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងខួរក្បាលរបស់អ្នកជំងឺដែលមានជំងឺ synucleinopathies 30 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គេដឹងតិចតួចអំពីមូលដ្ឋានម៉ូលេគុលនៃអន្តរកម្មរវាង αS និង tau និងយន្តការនៃការប្រមូលផ្តុំរបស់វា។αS ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាមានអន្តរកម្មជាមួយ tau តាមរយៈការទាក់ទាញអេឡិចត្រូស្ទិករវាងតំបន់ C-terminal ដែលមានបន្ទុកអវិជ្ជមានខ្ពស់នៃ αS និងតំបន់ដែលសំបូរទៅដោយប្រូលីនកណ្តាលនៃ tau ដែលសំបូរទៅដោយសំណល់ដែលមានបន្ទុកវិជ្ជមានផងដែរ។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបង្ហាញថា αS ពិតជាអាចបំបែកទៅជាដំណក់ទឹកតាមរយៈការ condensation ស្មុគ្រស្មាញ electrostatic នៅក្នុងវត្តមាននៃប្រូតេអ៊ីន tau ផ្ទុយទៅនឹងអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយ polypeptides ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមានផ្សេងទៀតដូចជា poly-L-lysine (pLK) និងនៅក្នុងដំណើរការនេះ។αS ដើរតួជាម៉ូលេគុល scaffold សម្រាប់បណ្តាញដំណក់ទឹក។យើងបានរកឃើញភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងដំណើរការនៃភាពចាស់ទុំនៃ electrostatic αS coacervates ដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងភាពខុសគ្នានៅក្នុងភាពខ្លាំងនិងភាពរឹងមាំនៃអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងបណ្តាញ coacervate ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានសង្កេតឃើញការរួមផ្សំនៃប្រូតេអ៊ីន αS និង tau amyloid នៅក្នុង coacervates រាវដែលមានអាយុកាលយូរ និងបានកំណត់កត្តាសំខាន់ៗមួយចំនួនដែលនាំទៅដល់ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះនៅក្នុង coacervates បែបនេះ។នៅទីនេះយើងពណ៌នាយ៉ាងលម្អិតអំពីដំណើរការនេះ ដែលជាយន្តការម៉ូលេគុលដែលអាចធ្វើទៅបានដែលស្ថិតនៅក្រោមការបង្រួបបង្រួមនៃប្រូតេអ៊ីនពីរនៅក្នុងការរួមបញ្ចូលជំងឺជាក់លាក់។
αS មានកន្ទុយ C-terminal ខ្ពស់នៅ pH អព្យាក្រឹត (រូបភាពទី 1a) ហើយយើងបានសន្មត់ថា វាអាចឆ្លងកាត់ LLPS តាមរយៈការ condensation នៃស្មុគស្មាញអេឡិចត្រូស្តាតជាមួយនឹងម៉ូលេគុល polypeptide disordered polycationic ។យើងបានប្រើ 100-residue poly-L-lysine (pLK) ជាម៉ូលេគុលគំរូចាប់ផ្តើម ដោយសារលក្ខណៈវត្ថុធាតុ polymeric ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមាន និងមិនមានសណ្តាប់ធ្នាប់នៅ pH 32 អព្យាក្រឹត។ ជាដំបូង យើងបានបញ្ជាក់ថា pLK ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ Ct domain នៃ αS តាមរយៈដំណោះស្រាយ NMR spectroscopy (រូបភាពទី 1b) ដោយប្រើ 13C/15N-labeled αS នៅក្នុងវត្តមាននៃការកើនឡើង αS:pLK molar ratios ។អន្តរកម្មនៃ pLK ជាមួយ Ct-domain នៃαS បង្ហាញដោយខ្លួនវាផ្ទាល់នៅក្នុងការរំខាននៃការផ្លាស់ប្តូរគីមី និងការថយចុះនៃអាំងតង់ស៊ីតេខ្ពស់បំផុតនៅក្នុងតំបន់នៃប្រូតេអ៊ីននេះ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍នៅពេលដែលយើងលាយ αS ជាមួយ pLK នៅកំហាប់ αS ប្រហាក់ប្រហែល។5-25 µM នៅក្នុងវត្តមាននៃសារធាតុ polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (សតិបណ្ដោះអាសន្ន LLPS ធម្មតា: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ភ្លាមៗយើងបានឆ្លងកាត់វាលធំទូលាយនៃការបង្កើតប្រូតេអ៊ីន។ .ដំណក់ទឹកត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើ fluorescence (WF) និងមីក្រូទស្សន៍ភ្លឺ (BF) (រូបភាព 1c) ។ដំណក់ទឹក 1-5 µm ដែលមាន αS ប្រមូលផ្តុំ (បានបន្ថែម 1 µM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS) លក្ខណៈសម្បត្តិអេឡិចត្រូស្តាតរបស់វាអាចទទួលបានពីភាពធន់របស់ពួកគេទៅនឹង 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) និងភាពប្រែប្រួលរបស់វាចំពោះ ការកើនឡើងនៃកំហាប់ NaCl (រូបភាព 1c) ។លក្ខណៈដូចសារធាតុរាវនៃ coacervates នៃ αS/pLK electrostatic complex ត្រូវបានបង្ហាញដោយសមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការ fuse ក្នុងមីលីវិនាទី (រូបភាពទី 1 ឃ)។ដោយប្រើ turbidimetry យើងបានកំណត់បរិមាណនៃការបង្កើតដំណក់ទឹកនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងនេះបានបញ្ជាក់ពីលក្ខណៈអេឡិចត្រូស្តាទិចនៃអន្តរកម្មសំខាន់ដែលទាក់ទងនឹងស្ថេរភាពរបស់វា (រូបភាព 1e) និងបានវាយតម្លៃឥទ្ធិពលនៃសមាមាត្រវត្ថុធាតុ polymer ផ្សេងៗលើដំណើរការ LLPS (រូបភាព 1f) ។ទោះបីជាការបង្កើតដំណក់ទឹកត្រូវបានគេសង្កេតឃើញលើជួរដ៏ធំទូលាយនៃសមាមាត្រវត្ថុធាតុ polymer, ដំណើរការនេះគឺអំណោយផលខ្លាំងណាស់នៅពេលដែល pLK លើសពីαS។LLPs ក៏ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញផងដែរដោយប្រើភ្នាក់ងារផ្លាស់ប្តូរគីមី dextran-70 (70 kDa) ឬប្រើទម្រង់គំរូជាច្រើន រួមទាំងដំណក់ទឹកកញ្ចក់ អណ្តូងមីក្រូចាននៃវត្ថុធាតុផ្សេងៗ Eppendorf ឬ quartz capillaries ។
តំណាងគ្រោងការណ៍នៃតំបន់ប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងវ៉ារ្យ៉ង់ WT-αS និង ΔCt-αS ដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះ។ដែន amphipathic N-terminal តំបន់ hydrophobic amyloid-forming (NAC) និងដែន C-terminal ចោទប្រកាន់អវិជ្ជមានត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ខៀវ ពណ៌ទឹកក្រូច និងក្រហមរៀងៗខ្លួន។ផែនទី Net Charge Per Residual (NCPR) នៃ WT-αS ត្រូវបានបង្ហាញ។b ការវិភាគ NMR នៃអន្តរកម្ម αS/pLK ក្នុងអវត្តមាននៃចង្កោម macromolecular ។នៅពេលដែលកំហាប់ pLK កើនឡើង (αS:pLK សមាមាត្រ molar 1:0.5, 1:1.5, និង 1:10 ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌បៃតងខ្ចី បៃតង និងបៃតងងងឹត រៀងគ្នា)។c Coacervate αS/pLK (សមាមាត្រ molar 1:10) នៅ 25 µM (1 µM AF488-labeled αS ឬ Atto647N-labeled pLK សម្រាប់រូបភាព WF) ក្នុង LLPS buffer (ខាងលើ) ឬបន្ថែមដោយ 500 mM NaCl (10 ខាងក្រោមខាងឆ្វេង) ឬបន្ទាប់ពី % 1,6-hexanediol (1,6-HD; បាតស្តាំ) ។របារមាត្រដ្ឋាន = 20 µm ។ឃ រូបភាពមីក្រូទស្សន៍តំណាងនៃដំណក់ទឹក BF នៃ αS/pLK (សមាមាត្រម៉ូលេគុល 1:10) នៅកំហាប់ 25 μM;ព្រួញបង្ហាញពីការបញ្ចូលគ្នានៃតំណក់នីមួយៗ (ព្រួញក្រហម និងលឿង) ទៅក្នុងតំណក់ថ្មី (ព្រួញពណ៌ទឹកក្រូច) ក្នុងរយៈពេល 200 ms) ។របារមាត្រដ្ឋាន = 20 µm ។e ការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺ (នៅ 350 nm) ការប្រមូលផ្តុំ αS/pLK នៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន LLPS មុននិងក្រោយការបន្ថែម 500 mM NaCl ឬ 10% 1,6-HD នៅ 25 µM αS (N = 3 គំរូចម្លង មធ្យម និងគម្លាតស្តង់ដារក៏បានបង្ហាញផងដែរ) ។f រូបភាព BF (កំពូល) និងការវិភាគការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺ (នៅ 350 nm, ខាងក្រោម) នៃ αS/pLK សរុបនៅ 25 μM αS ជាមួយនឹងការកើនឡើង αS: pLK molar ratio (N = 3 គំរូចម្លង មធ្យម និងគម្លាតស្តង់ដារក៏បានចង្អុលបង្ហាញផងដែរ) ។របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm ។របារមាត្រដ្ឋាននៅលើរូបភាពមួយបង្ហាញពីមាត្រដ្ឋាននៃរូបភាពទាំងអស់នៅក្នុងបន្ទះមួយ។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ដោយផ្អែកលើការសង្កេតរបស់យើងនៃការខាប់ស្មុគ្រស្មាញ αS/pLK និងការសង្កេតពីមុននៃ αS ជាម៉ូលេគុលអតិថិជននៃ condensate tau/RNA តាមរយៈអន្តរកម្មផ្ទាល់ជាមួយ tau31 យើងបានសន្មត់ថា αS និង tau អាចរួមផ្សំជាមួយសារធាតុរំលាយនៅក្នុងអវត្តមាននៃ RNA ។ condensation ។តាមរយៈស្មុគ្រស្មាញអេឡិចត្រូស្ទិក ហើយ αS គឺជាប្រូតេអ៊ីនរន្ទានៅក្នុង αS/Tau coacervates (សូមមើលការចែកចាយបន្ទុក tau ក្នុងរូបភាពទី 2e)។យើងបានសង្កេតឃើញថានៅពេលដែល 10 μM αS និង 10 μM Tau441 (មាន 1 μM AF488-αS និង 1 μM Atto647N-Tau រៀងគ្នា) ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នានៅក្នុង LLPS buffer ពួកវាបង្កើតបានយ៉ាងងាយស្រួលនូវប្រូតេអ៊ីនដែលមានប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរ ដូចដែលបានឃើញដោយមីក្រូទស្សន៍ WF ។(រូបទី 2 ក) ។ការធ្វើអាណានិគមនៃប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនៅក្នុងដំណក់ទឹកត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយមីក្រូទស្សន៍ confocal (CF) (រូបភាពបន្ថែម 1a) ។អាកប្បកិរិយាស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅពេលដែល dextran-70 ត្រូវបានគេប្រើជាភ្នាក់ងារប្រមូលផ្តុំ (រូបភាពបន្ថែម 1c) ។ដោយប្រើ FITC-labeled PEG ឬ dextran យើងបានរកឃើញថាភ្នាក់ងារប្រមូលផ្តុំទាំងពីរត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅទូទាំងគំរូ ដោយមិនបង្ហាញពីការបំបែក ឬសមាគម (រូបភាពបន្ថែម 1d)។ផ្ទុយទៅវិញ វាបង្ហាញថានៅក្នុងប្រព័ន្ធនេះ ពួកគេលើកកម្ពស់ការបំបែកដំណាក់កាលតាមរយៈឥទ្ធិពលហ្វូងមនុស្សម៉ាក្រូម៉ូលេគុល ចាប់តាំងពី PEG គឺជាភ្នាក់ងារហ្វូងមនុស្សដែលមានស្ថេរភាពល្អដូចដែលបានឃើញនៅក្នុងប្រព័ន្ធ LLP ផ្សេងទៀត33,34។ដំណក់ទឹកដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះមានភាពរសើបចំពោះ NaCl (1 M) ប៉ុន្តែមិនមែនដល់ 1,6-HD (10% v/v) ដោយបញ្ជាក់ពីលក្ខណៈសម្បត្តិអេឡិចត្រូស្តាតរបស់វា (រូបភាពបន្ថែម 2a, ខ)។ឥរិយាបទសារធាតុរាវរបស់ពួកគេត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការសង្កេតមើលព្រឹត្តិការណ៍នៃដំណក់ទឹកដែលរួមបញ្ចូលគ្នាជាមិល្លីវិនាទីដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ BF (រូបភាព 2b) ។
រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ Confocal (CF) នៃ αS/Tau441 coacervates នៅក្នុង LLPS buffer (10 μM នៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ 0.5 μM នៃ αS ដែលមានស្លាក AF488 និង Atto647N-labeled Tau441)។b រូបភាពនៃការជ្រៀតជ្រែកឌីផេរ៉ង់ស្យែលតំណាង (DIC) នៃព្រឹត្តិការណ៍ αS/Tau441 droplet fusion (10 μM សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ)។c ដ្យាក្រាមដំណាក់កាលផ្អែកលើការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺ (នៅ 350 nm) នៃ Tau441 LLPS (0-15 µM) ក្នុងអវត្តមាន (ឆ្វេង) ឬវត្តមាន (ស្តាំ) នៃ 50 µM αS ។ពណ៌ក្តៅបង្ហាញពីការខ្ចាត់ខ្ចាយកាន់តែច្រើន។d ការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺនៃគំរូ αS/Tau441 LLPS ជាមួយនឹងការបង្កើនកំហាប់αS (Tau441 នៅ 5 µM, N = 2-3 ពាក្យដដែលៗដូចដែលបានចង្អុលបង្ហាញ) ។e ការបង្ហាញគ្រោងការណ៍នៃបំរែបំរួលប្រូតេអ៊ីន tau មួយចំនួន និងតំបន់ផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានប្រើក្នុងការសិក្សានេះ៖ ដែន N-terminal domain (ក្រហម) ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់អវិជ្ជមាន (ក្រហម) តំបន់សម្បូរប្រូលីន (ពណ៌ខៀវ) ដែន microtubule-binding (MTBD បន្លិចជាពណ៌ទឹកក្រូច) និង វង់គូដែលបង្កើតជាអាមីឡូអ៊ីដ។តំបន់ filament (PHF) ដែលមានទីតាំងនៅក្នុង MTBD (ពណ៌ប្រផេះ) ។ផែនទី Net Charge Per Residue (NCPR) នៃ Tau441 ត្រូវបានបង្ហាញ។f ដោយប្រើ 1 µM AF488-labeled αS និង Atto647N-labeled ΔNt- ដោយប្រើ 1 µM AF488-labeled αS ឬ ΔCt-αS ក្នុងវត្តមាន ΔNt-Tau (កំពូល 10 µM ក្នុងមួយប្រូតេអ៊ីន) ឬ K18 (បាត 50 μM ) ) ) មីក្រូក្រាហ្វនៃ WF condensed ក្នុង LLPS ឬ K18 buffer ។របារមាត្រដ្ឋាននៅក្នុងរូបភាពមួយតំណាងឱ្យមាត្រដ្ឋាននៃរូបភាពទាំងអស់នៅក្នុងបន្ទះមួយ (20 µm សម្រាប់បន្ទះ a, b និង f) ។ទិន្នន័យដើមសម្រាប់បន្ទះ c និង d ត្រូវបានផ្តល់ជាឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ដើម្បីសាកល្បងតួនាទីរបស់ αS នៅក្នុងដំណើរការ LLPS នេះដំបូង យើងបានស៊ើបអង្កេតពីឥទ្ធិពលនៃ αS ទៅលើស្ថេរភាពនៃដំណក់ទឹកដោយ nephelometry ដោយប្រើការបង្កើនកំហាប់នៃ NaCl (រូបភាព 2c) ។កំហាប់អំបិលកាន់តែខ្ពស់នៅក្នុងសំណាកដែលមាន αS តម្លៃនៃការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺកាន់តែខ្ពស់ (នៅ 350 nm) ដែលបង្ហាញពីតួនាទីស្ថេរភាពនៃ αS នៅក្នុងប្រព័ន្ធ LLPS នេះ។ឥទ្ធិពលស្រដៀងគ្នានេះអាចត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយការបង្កើនកំហាប់αS (ហើយដូច្នេះសមាមាត្រαS: Tau441) ទៅប្រហាក់ប្រហែល។ការកើនឡើង 10 ដងទាក់ទងទៅនឹងកំហាប់ tau (5 µM) (រូបភាព 2 ឃ) ។ដើម្បីបង្ហាញថា αS គឺជាប្រូតេអ៊ីន scaffold នៅក្នុង coacervates យើងបានសម្រេចចិត្តស៊ើបអង្កេតឥរិយាបថរបស់ Tau mutant ដែលរំខាន LLPS ដែលខ្វះតំបន់ N-terminal ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់អវិជ្ជមាន (សំណល់ 1-150 សូមមើលរូបភព 2e) ដែលហៅថា ΔNt-Tau ។WF microscopy និង nephelometry បានបញ្ជាក់ថា ΔNt-Tau ខ្លួនវាមិនបានឆ្លងកាត់ LLPS (រូបភាព 2f និងរូបភាពបន្ថែម។ 2d) ដូចដែលបានរាយការណ៍ពីមុន 14។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលដែល αS ត្រូវបានបន្ថែមទៅដំណោះស្រាយបែកខ្ចាត់ខ្ចាយនៃវ៉ារ្យ៉ង់ Tau ដែលត្រូវបានកាត់បន្ថយនេះ ដំណើរការ LLPS គឺទាំងស្រុង។ ត្រូវបានស្តារឡើងវិញជាមួយនឹងដង់ស៊ីតេដំណក់ទឹកជិតនឹងដង់ស៊ីតេដំណក់ទឹកនៃដំណោះស្រាយទំហំពេញនៃ Tau និង αS ក្រោមលក្ខខណ្ឌស្រដៀងគ្នា និងការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន។ដំណើរការនេះក៏អាចត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃការប្រមូលផ្តុំម៉ាក្រូម៉ូលេគុលទាប (រូបភាពបន្ថែម 2c) ។តួនាទីរបស់ស្ថានីយ C-terminal αS ប៉ុន្តែមិនមែនប្រវែងទាំងមូលរបស់វាទេ នៅក្នុងដំណើរការ LLPS ត្រូវបានបង្ហាញដោយការរារាំងនៃការបង្កើតដំណក់ទឹកដោយប្រើវ៉ារ្យ៉ង់ C-terminal αS ដែលកាត់ដោយខ្វះសំណល់ 104–140 (រូបភាព 1a) នៃ (ΔCt- αS) ប្រូតេអ៊ីន (រូបភាព 2f និងបន្ថែម រូបភព 2d) ។ការធ្វើអាណានិគមនៃ αS និង ΔNt-Tau ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយមីក្រូទស្សន៍ fluorescence confocal (រូបភាពបន្ថែម 1b) ។
ដើម្បីសាកល្បងបន្ថែមទៀតនូវយន្តការ LLPS រវាង Tau441 និង αS វ៉ារ្យ៉ង់ Tau បន្ថែមមួយត្រូវបានប្រើប្រាស់ ពោលគឺបំណែកស្នូលសរសៃអំបោះដែលបានផ្គូផ្គង (PHF) នៅក្នុង microtubule-binding domain (MTBD) ដែលប្រសិនបើវាមានដែនដដែលៗចំនួនបួន ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ជាទូទៅផងដែរ។ ជាបំណែក K18 (សូមមើលរូប 2e)។ថ្មីៗនេះវាត្រូវបានគេរាយការណ៍ថា αS ភ្ជាប់ជាអាទិភាពទៅនឹងប្រូតេអ៊ីន tau ដែលមានទីតាំងនៅក្នុងដែនដែលសំបូរទៅដោយប្រូលីនក្នុងលំដាប់មួយដែលនាំមុខដែន microtubule-binding ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ តំបន់ PHF ក៏សម្បូរទៅដោយសំណល់ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមានផងដែរ (សូមមើលរូបភាពទី 2e) ជាពិសេស lysine (សំណល់ 15%) ដែលជំរុញឱ្យយើងសាកល្បងថាតើតំបន់នេះក៏រួមចំណែកដល់ការប្រមូលផ្តុំនៃស្មុគស្មាញ αS/Tau ផងដែរ។យើងបានសង្កេតឃើញថា K18 តែម្នាក់ឯងមិនអាចបង្កឱ្យមាន LLPS នៅកំហាប់រហូតដល់ 100 μM ក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលបានសាកល្បង (LLPS buffer ជាមួយ 15% PEG ឬ 20% dextran) (រូបភាព 2f) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលដែលយើងបន្ថែម 50 µM αS ទៅ 50 µM K18 ការបង្កើតយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃដំណក់ទឹកប្រូតេអ៊ីនដែលមាន K18 និង αS ត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយ nephelometry (រូបភាពបន្ថែម 2d) និងមីក្រូទស្សន៍ WF (រូបភាព 2f) ។ដូចដែលបានរំពឹងទុក ΔCt-αS មិនអាចស្តារឥរិយាបថ LLPS របស់ K18 (រូបភាព 2f) បានទេ។យើងកត់សំគាល់ថាការប្រមូលផ្តុំ αS/K18 ទាមទារកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនខ្ពស់ជាងបន្តិចដើម្បីជំរុញ LLPS បើប្រៀបធៀបទៅនឹង αS/ΔNt-Tau ឬ αS/Tau441 អ្វីៗផ្សេងទៀតគឺស្មើគ្នា។នេះគឺស្របជាមួយនឹងអន្តរកម្មកាន់តែខ្លាំងនៃតំបន់ស្ថានីយ αS C ជាមួយដែន Tau ដែលមានប្រូលីន បើប្រៀបធៀបទៅនឹងដែនភ្ជាប់ microtubule ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 31 ។
ដោយមើលឃើញថា ΔNt-Tau មិនអាចអនុវត្ត LLPS ក្នុងអវត្តមាននៃαS យើងបានជ្រើសរើសវ៉ារ្យ៉ង់ Tau នេះធ្វើជាគំរូសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈ αS/Tau LLPS ដែលផ្តល់ភាពសាមញ្ញរបស់វានៅក្នុងប្រព័ន្ធ LLPS ជាមួយនឹង Tau ពេញប្រវែង (isotype, Tau441/Tau441) ។ជាមួយនឹងដំណើរការប្រមូលផ្តុំស្មុគស្មាញ (heterotypic, αS/Tau441) ។យើងបានប្រៀបធៀបកម្រិតនៃការប្រមូលផ្តុំαS (ជាផ្នែកមួយនៃប្រូតេអ៊ីនដំណាក់កាល condensed, fαS, c) នៅក្នុងប្រព័ន្ធ αS/Tau និង αS/ΔNt-Tau ដោយការវិភាគ centrifugation និងដំណាក់កាលបំបែក SDS-PAGE (សូមមើល 2e) បានរកឃើញតម្លៃស្រដៀងគ្នាខ្លាំងណាស់ សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់ដែលមានកំហាប់ដូចគ្នា។ជាពិសេស យើងទទួលបាន fαS,c 84 ± 2% និង 79 ± 7% សម្រាប់ αS/Tau និង αS/ΔNt-Tau រៀងគ្នា ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មតំណពូជរវាង αS និង tau គឺប្រសើរជាងអន្តរកម្មរវាងម៉ូលេគុល tau ។រវាង
អន្តរកម្មជាមួយ polycations ផ្សេងៗ និងឥទ្ធិពលនៃដំណើរការ condensation លើ αS kinetics ត្រូវបានសិក្សាជាលើកដំបូងដោយ fluorescence recovery បន្ទាប់ពី photobleaching (FRAP) method ។យើងបានធ្វើតេស្ត αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau និង αS/pLK coacervates (100 μM αS បន្ថែមដោយ 2 μM αS AF488-αS និង 100 μM Tau441 ឬ ΔNt-Tau ឬ 1 mM pLK) ។ទិន្នន័យត្រូវបានទទួលក្នុងរយៈពេល 30 នាទីដំបូងបន្ទាប់ពីលាយសមាសធាតុគំរូ។ពីរូបភាព FRAP តំណាង (Fig ។ 3a, αS/Tau441 condensation) និងខ្សែកោងវគ្គសិក្សាពេលវេលាដែលត្រូវគ្នារបស់ពួកគេ (រូបភាព 3b, រូបភពបន្ថែម 3) វាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថា αS kinetics គឺស្រដៀងទៅនឹងរូបភាពនៃ Tau441 coacervates ។និង ΔNt-Tau ដែលលឿនជាងជាមួយ pLK ។មេគុណនៃការសាយភាយដែលបានគណនាសម្រាប់ αS នៅខាងក្នុង coacervate យោងទៅតាម FRAP (ដូចដែលបានពិពណ៌នាដោយ Kang et al. 35) គឺ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s និង D = 0.026 ± 0.008 µm2/s សម្រាប់ αS/Tau/Tau4/s ប្រព័ន្ធ αS/ ។pLK, Tau, និង D = 0.18 ± 0.04 µm2/s រៀងគ្នា (រូបភាព 3c) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មេគុណនៃការសាយភាយ αS ក្នុងដំណាក់កាលបែកខ្ញែកគឺជាលំដាប់ជាច្រើននៃរ៉ិចទ័រខ្ពស់ជាងដំណាក់កាលខាប់ទាំងអស់ ដូចដែលបានកំណត់ដោយ Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS សូមមើលរូបបន្ថែមទី 3) ក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា (LLPS buffer) ប៉ុន្តែក្នុងករណីដែលមិនមាន polycations (D = 8 ± 4 µm2/s) ។ដូច្នេះ kinetics នៃការបកប្រែ αS ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង coacervates បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងដំណាក់កាលដែលបែកខ្ញែកដោយសារតែឥទ្ធិពលនៃការប្រមូលផ្តុំម៉ូលេគុលដែលបញ្ចេញសំឡេង ទោះបីជា coacervates ទាំងអស់រក្សាបាននូវលក្ខណៈសម្បត្តិដូចរាវក្នុងអំឡុងពេលកន្លះម៉ោងដំបូងបន្ទាប់ពីការបង្កើតរបស់ពួកគេ ផ្ទុយទៅនឹងដំណាក់កាល tau ។kinetics លឿនជាងមុននៅក្នុង pLK condensate ។
a–c ការវិភាគ FRAP នៃ αS ថាមវន្ត (αS ដែលមានស្លាក 2% AF488) នៅក្នុង coacervates អេឡិចត្រូត។រូបភាពតំណាងនៃការវិភាគ αS/Tau441 FRAP ជាបីដងត្រូវបានបង្ហាញក្នុង (a) ដែលរង្វង់ពណ៌ក្រហមបង្ហាញពីតំបន់ដែលមានពណ៌។របារមាត្រដ្ឋានគឺ 5 µm ។b ខ្សែកោង FRAP ជាមធ្យម និង (c) មេគុណនៃការសាយភាយដែលបានគណនា (D) សម្រាប់ 5–6 (N) ដំណក់ទឹកផ្សេងៗគ្នាពីការពិសោធន៍បីដោយប្រើ 100 µM αS និងការប្រមូលផ្តុំស្មើគ្នានៃ Tau441 (ក្រហម) ឬ ΔNt-Tau (ខៀវ) ឬ pLK (បៃតង) នៅដប់ដងនៃការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ LLPS ។គម្លាតស្តង់ដារនៃខ្សែកោង FRAP ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ស្រមោល។សម្រាប់ការប្រៀបធៀប មេគុណនៃការសាយភាយ αS ក្នុងដំណាក់កាលបែកខ្ញែកត្រូវបានកំណត់ជាបីដងដោយប្រើ fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (សូមមើលរូបភាពបន្ថែមទី 3 និងវិធីសាស្រ្តសម្រាប់ព័ត៌មានបន្ថែម)។d វិសាលគម X-band EPR បន្តនៃ 100 μM TEMPOL-122-αS ក្នុង LLPS buffer ដោយគ្មាន polycation (ខ្មៅ) ឬនៅក្នុងវត្តមាននៃ 100 μM Tau441 (ក្រហម) ឬ ΔNt-Tau (ខៀវ) ឬ 1 mM pLK (បៃតង) ។ធាតុបញ្ចូលបង្ហាញទិដ្ឋភាពពង្រីកនៃបន្ទាត់វាលខ្លាំង ដែលការផ្លាស់ប្តូរខ្លាំងបំផុតកើតឡើង។e ការចងខ្សែកោងនៃ 50 μM TEMPOL-122-αS ជាមួយនឹង polycations ជាច្រើននៅក្នុងអវត្តមាននៃ LLPS (គ្មាន PEG) ។ការថយចុះទំហំនៃក្រុមតន្រ្តី III បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមទី II (III / III) នៃវិសាលគម EPR ធម្មតាត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីបង្កើនសមាមាត្រថ្គាមនៃ Tau441 (ក្រហម) ΔNt-Tau (ខៀវ) និង pLK (បៃតង) ។បន្ទាត់​ពណ៌​បង្ហាញ​សម​នឹង​ទិន្នន័យ​ដោយ​ប្រើ​គំរូ​ចង​រដុប​ដែល​មាន​ទីតាំង​ចង​ដូចគ្នា​និង​ឯករាជ្យ​នៅលើ​ខ្សែកោង​នីមួយៗ។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ក្នុងនាមជាការបំពេញបន្ថែម យើងបានស៊ើបអង្កេតពីសក្ដានុពលនៃ αS នៅក្នុង coacervates ផ្សេងៗ ដោយប្រើស្លាកសញ្ញាបង្វិលដែលដឹកនាំ (SDSL) និងអនុភាពអេឡិចត្រូម៉ាញ៉េទិចបន្ត (CW-EPR) ។វិធីសាស្រ្តនេះបានបង្ហាញថាមានប្រយោជន៍ខ្លាំងណាស់ក្នុងការរាយការណ៍ពីភាពបត់បែន និងសក្ដានុពលរបស់ IDP ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយសំណល់ជាក់ស្តែង 36,37,38។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ យើងបានសាងសង់សំណល់ cysteine ​​​​នៅក្នុងសារធាតុបំប្លែង Cys តែមួយ ហើយបានប្រើ 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probe ។និស្សន្ទវត្ថុ Maleimide ដាក់ស្លាកពួកគេ។ពិសេសជាងនេះទៅទៀត យើងបានបញ្ចូលការស៊ើបអង្កេត TEMPOL នៅទីតាំង 122 ឬ 24 αS (TEMPOL-122-αS និង TEMPOL-24-αS) ។ក្នុងករណីដំបូង យើងកំណត់គោលដៅតំបន់ C-terminal នៃប្រូតេអ៊ីន ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មជាមួយ polycations ។ផ្ទុយទៅវិញ ទីតាំង 24 អាចផ្តល់ឱ្យយើងនូវព័ត៌មានអំពីសក្ដានុពលទាំងមូលនៃប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង condensate ។ក្នុងករណីទាំងពីរនេះ សញ្ញា EPR ដែលទទួលបានសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននៃដំណាក់កាលបែកខ្ញែកត្រូវគ្នាទៅនឹងរ៉ាឌីកាល់ nitroxide នៅក្នុងស្ថានភាពផ្លាស់ទីលឿន។បន្ទាប់ពីការបំបែកដំណាក់កាលនៅក្នុងវត្តមាននៃ tau ឬ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ឬ ΔNt-Tau នៅសមាមាត្រនៃ 1: 1 ឬ pLK នៅសមាមាត្រនៃ 1: 10) ការកើនឡើងនៃអាំងតង់ស៊ីតេកំពូលដែលទាក់ទងត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង វិសាលគម EPR នៃ αS ។បន្ទាត់នៃការបាត់បង់បានពង្រីកដែលបង្ហាញពីការថយចុះនៃ αS reorientation kinetics នៅក្នុងដំណក់ទឹកបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនក្នុងដំណាក់កាល dilute (រូបភាព 3d, រូបភពបន្ថែម 4a) ។ការផ្លាស់ប្តូរទាំងនេះកាន់តែច្បាស់នៅទីតាំង 122។ ខណៈពេលដែលនៅទីតាំង 24 វត្តមានរបស់ pLK មិនប៉ះពាល់ដល់ kinetics នៃការស៊ើបអង្កេតនោះទេ នៅទីតាំង 122 រូបរាងបន្ទាត់វិសាលគមបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំង (រូបភាពបន្ថែម 4a) ។នៅពេលដែលយើងព្យាយាមធ្វើគំរូវិសាលគមនៅទីតាំង 122 នៃប្រព័ន្ធαS/polycation ពីរដោយប្រើគំរូ isotropic (រូបភាពបន្ថែម 5a) ដែលប្រើជាទូទៅដើម្បីពិពណ៌នាអំពីឌីណាមិកនៃស្លាកសញ្ញាបង្វិល IDP38,39 យើងមិនអាចបង្កើតវិសាលគមពិសោធន៍ឡើងវិញបានទេ។.ការក្លែងធ្វើវិសាលគមនៃទីតាំងនៃ 24 ការបង្វិលផ្ទុយ (រូបភាពបន្ថែម 5a) ។នេះបង្ហាញថាមានមុខតំណែងអាទិភាពនៅក្នុងចន្លោះនៃការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធបង្វិលនៃតំបន់ C-terminal នៃαS នៅក្នុងវត្តមាននៃ polycations ។នៅពេលពិចារណាប្រភាគនៃαSក្នុងដំណាក់កាលខាប់ក្រោមលក្ខខណ្ឌ EPR ពិសោធន៍ (84 ± 2%, 79 ± 7%, និង 47 ± 4% សម្រាប់ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau និង αS/pLK រៀងគ្នា — សូមមើលបន្ថែម រូបភាពទី 2e នៃការវិភាគទិន្នន័យ គ) វាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថាការពង្រីកដែលបានរកឃើញដោយវិធីសាស្ត្រ EPR ឆ្លុះបញ្ចាំងជាចម្បងអំពីអន្តរកម្មនៃតំបន់ C-terminal αS ជាមួយនឹង polycations ផ្សេងៗនៅក្នុងដំណាក់កាល condensed (ការផ្លាស់ប្តូរសំខាន់នៅពេលប្រើ TEMPOL-122- αS) និងមិនមែនជា condensation ប្រូតេអ៊ីន។ការកើនឡើងនៃ microviscosity ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងការស៊ើបអង្កេត។ដូចដែលបានរំពឹងទុក វិសាលគម EPR នៃប្រូតេអ៊ីនក្រោមលក្ខខណ្ឌក្រៅពី LLPS ត្រូវបានស្ដារឡើងវិញទាំងស្រុងនៅពេលដែល 1 M NaCl ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងល្បាយ (រូបភាពបន្ថែម 4b)។សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងណែនាំថាការផ្លាស់ប្តូរដែលបានរកឃើញដោយ CW-EPR ជាចម្បងឆ្លុះបញ្ចាំងពីអន្តរកម្មនៃតំបន់ C-terminal αS ជាមួយនឹង polycations ផ្សេងៗនៅក្នុងដំណាក់កាល condensed ហើយអន្តរកម្មនេះហាក់ដូចជាខ្លាំងជាមួយ pLK ជាង Tau ។
ដើម្បីទទួលបានព័ត៌មានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ថែមទៀតអំពីប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង coacervate យើងបានសម្រេចចិត្តសិក្សាប្រព័ន្ធ LLPS ដោយប្រើ NMR នៅក្នុងដំណោះស្រាយ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងអាចរកឃើញតែប្រភាគ αS ដែលនៅសេសសល់ក្នុងដំណាក់កាលបែកខ្ញែក ដែលអាចបណ្តាលមកពីការថយចុះនៃឌីណាមិកប្រូតេអ៊ីននៅខាងក្នុង coacervate និងដំណាក់កាលក្រាស់នៅផ្នែកខាងក្រោមនៃដំណោះស្រាយក្នុងការវិភាគ NMR ។នៅពេលដែលយើងវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធ និងសក្ដានុពលនៃប្រូតេអ៊ីនដែលនៅសេសសល់ក្នុងដំណាក់កាលបែកខ្ញែកនៃគំរូ LLPS ដោយប្រើ NMR (រូបភាពបន្ថែម 5c, d) យើងសង្កេតឃើញថា ប្រូតេអ៊ីនមានឥរិយាបថស្ទើរតែដូចគ្នានៅក្នុងវត្តមានរបស់ pLK និង ΔNt-Tau ទាំងពីរ។ ដែលស្ថិតនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ និងថាមវន្តនៃឆ្អឹងខ្នងប្រូតេអ៊ីន បានបង្ហាញដោយការពិសោធន៍លើការផ្លាស់ប្តូរគីមីបន្ទាប់បន្សំ និងការបន្ធូរបន្ថយ R1ρ ។ទិន្នន័យ NMR បង្ហាញថា C-terminus នៃ αS ទទួលរងការបាត់បង់យ៉ាងសំខាន់នៃភាពបត់បែនតាមទម្រង់ ខណៈពេលដែលរក្សាបាននូវលក្ខណៈមិនប្រក្រតីរបស់វា ដូចជាផ្នែកផ្សេងទៀតនៃប្រូតេអ៊ីន ដោយសារអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយ polycations ។
ចាប់តាំងពីការពង្រីកសញ្ញា CW-EPR សង្កេតឃើញនៅក្នុងដំណាក់កាលខាប់ TEMPOL-122-αS ឆ្លុះបញ្ចាំងពីអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនជាមួយ polycations យើងបានធ្វើ titration EPR ដើម្បីវាយតម្លៃភាពជាប់ទាក់ទងនៃ αS ទៅនឹង polycations ផ្សេងៗ ក្នុងករណីដែលគ្មាន LLPS (គ្មានការប្រមូលផ្តុំនៃ Buffer LLPS) ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មគឺដូចគ្នានៅក្នុងដំណាក់កាលដែលពនឺ និងផ្តោតអារម្មណ៍ (ដែលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយទិន្នន័យរបស់យើង រូបភពបន្ថែម 4a និងរូបភាពបន្ថែម 6)។គោលដៅគឺដើម្បីមើលថាតើ coacervates ទាំងអស់ ទោះបីជាមានលក្ខណៈសម្បត្តិដូចសារធាតុរាវធម្មតាក៏ដោយ បង្ហាញអាកប្បកិរិយាឌីផេរ៉ង់ស្យែលមូលដ្ឋានណាមួយនៅកម្រិតម៉ូលេគុល។ដូចដែលបានរំពឹងទុក វិសាលគម EPR បានពង្រីកជាមួយនឹងការបង្កើនកំហាប់ polycation ដែលឆ្លុះបញ្ចាំងពីការថយចុះនៃភាពបត់បែនរបស់ម៉ូលេគុលដោយសារតែអន្តរកម្មម៉ូលេគុលនៃដៃគូអន្តរកម្មទាំងអស់ស្ទើរតែដល់ការតិត្ថិភាព (រូបភាពទី 3e, រូបភពបន្ថែម 6) ។pLK សម្រេចបាននូវតិត្ថិភាពនេះនៅសមាមាត្រថ្គាមទាប (polycation:αS) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងΔNt-Tau និង Tau441។ជាការពិត ការប្រៀបធៀបទិន្នន័យជាមួយនឹងគំរូចងប្រហាក់ប្រហែលដែលសន្មត់ថា n ដូចគ្នាបេះបិទ និងកន្លែងចងឯករាជ្យ បានបង្ហាញថា ថេរ dissociation ជាក់ស្តែងនៃ pLK (~5 μM) គឺជាលំដាប់នៃរ៉ិចទ័រទាបជាង Tau441 ឬ ΔNt-Tau (~50 μM។ )µM)ទោះបីជានេះគឺជាការប៉ាន់ស្មានរដុបក៏ដោយ នេះបង្ហាញថា αS មានភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់ជាងសម្រាប់ polycations សាមញ្ញជាងមុន ជាមួយនឹងតំបន់បន្ទុកវិជ្ជមានជាបន្តបន្ទាប់។ដោយសារភាពខុសគ្នានេះនៅក្នុងភាពស្និទ្ធស្នាលរវាង αS និង polycations ផ្សេងៗ យើងបានសន្មត់ថាលក្ខណៈសម្បត្តិរាវរបស់វាអាចផ្លាស់ប្តូរខុសៗគ្នាតាមពេលវេលា ហើយដូច្នេះទទួលរងពីដំណើរការ LSPT ខុសៗគ្នា។
ដោយសារបរិយាកាសដែលមានមនុស្សច្រើននៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន coacervate និងធម្មជាតិ amyloid នៃប្រូតេអ៊ីន យើងបានសង្កេតមើលឥរិយាបថរបស់ coacervate តាមពេលវេលា ដើម្បីរកមើលដំណើរការ LSPT ដែលអាចកើតមាន។ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ BF និង CF (រូបភាពទី 4) យើងបានសង្កេតឃើញថា αS/Tau441 coacervates ក្នុងកម្រិតធំនៅក្នុងដំណោះស្រាយ បង្កើតជាដំណក់ទឹកធំៗដែលប៉ះ និងសើមលើផ្ទៃបាតអណ្តូង/ស្លាយជាដំណក់ទឹកពេញ ដូចដែលបានរំពឹងទុក (រូបបន្ថែម .7d);យើងហៅរចនាសម្ព័ន្ធខាងក្រោមទាំងនេះថា "ក្បូនប្រូតេអ៊ីន" ។រចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះនៅមានសភាពរាវដដែល ខណៈដែលពួកគេរក្សាបាននូវសមត្ថភាពក្នុងការផ្សំ (រូបភពបន្ថែម 7b) ហើយអាចត្រូវបានគេមើលឃើញរយៈពេលជាច្រើនម៉ោងបន្ទាប់ពី LLPS ត្រូវបានកេះ (រូបភាពទី 4 និងរូបភាពបន្ថែម 7c) ។យើងសង្កេតឃើញថា ដំណើរការសើមត្រូវបានអនុគ្រោះលើផ្ទៃ hydrophilic ជាជាងវត្ថុធាតុ hydrophobic (រូបភាពបន្ថែម 7a) ដូចដែលបានរំពឹងទុកសម្រាប់ coacervates electrostatic ជាមួយនឹងបន្ទុកមិនមានតុល្យភាព ហើយដូច្នេះសក្តានុពលនៃផ្ទៃ electrostatic ខ្ពស់។គួរកត់សម្គាល់ថា αS/ΔNt-Tau coalescence និងការជិះក្បូនត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង ខណៈពេលដែល αS/pLK condensates ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង (រូបភាព 4) ។ក្នុងអំឡុងពេលភ្ញាស់ខ្លី ដំណក់ទឹក αS/pLK អាចបង្រួបបង្រួម និងសើមផ្ទៃអ៊ីដ្រូហ្វីលីក ប៉ុន្តែដំណើរការនេះបានបញ្ឈប់យ៉ាងឆាប់រហ័ស ហើយបន្ទាប់ពីរយៈពេល 5 ម៉ោងនៃការភ្ញាស់ មានតែព្រឹត្តិការណ៍នៃការបង្រួបបង្រួមមានកំណត់ ហើយមិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញការសើមឡើយ។- ការផ្លាស់ប្តូរ gel-drip ។
តំណាង BF (បន្ទះពណ៌ប្រផេះ) និង CF (បន្ទះខាងស្តាំ αS ដែលមានស្លាក AF488 ជាពណ៌បៃតង) នៃគំរូ coacervate ដែលមាន 100 µM αS (ស្លាក fluorescent 1%) នៅក្នុង LLPS buffer នៅក្នុងវត្តមាននៃរូបភាព 100 µM Tau441 (កំពូល) fluorescence ΔN) -Tau (កណ្តាល) ឬ 1 mM pLK (បាត) នៅពេលវេលា incubation ផ្សេងគ្នា និងកម្ពស់ប្រសព្វ (z, ចម្ងាយពីបាតនៃចានបានយ៉ាងល្អ) ។ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀត 4-6 ដងដោយឯករាជ្យពីគ្នាទៅវិញទៅមកជាមួយនឹងលទ្ធផលដូចគ្នា។αS/Tau441 coacervates ត្រូវបានសើមបន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង បង្កើតជាក្បូនធំជាងរូបភាព។របារមាត្រដ្ឋានសម្រាប់រូបភាពទាំងអស់គឺ 20 µm ។
បន្ទាប់មក យើងបានសួរថាតើអាងទឹកប្រូតេអ៊ីនដូចវត្ថុរាវធំដែលបង្កើតឡើងក្នុង αS/Tau441 LLPS នឹងនាំទៅរកការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីដនៃប្រូតេអ៊ីនណាមួយដែលបានសិក្សា។យើងបានតាមដានភាពចាស់ទុំនៃដំណក់ទឹក αS/Tau441 តាមពេលវេលាជាមួយនឹងមីក្រូទស្សន៍ WF ក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នាដូចខាងលើ ប៉ុន្តែប្រើ 1 μM AF488-labeled αS និង Atto647N-labeled Tau441 (រូបភាព 5a)។ដូចដែលបានរំពឹងទុក យើងបានសង្កេតឃើញការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មប្រូតេអ៊ីនពេញលេញពេញមួយដំណើរការពេញវ័យ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ពី ca ។បន្ទាប់ពី 5 ម៉ោង រចនាសម្ព័ន្ធមិនរាងជារង្វង់ខ្លាំងជាងមុនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅខាងក្នុងក្បូន ដែលយើងហៅថា "ចំណុច" ដែលមួយចំនួនត្រូវបានបំប្លែងទៅជា αS ហើយខ្លះទៀតត្រូវបានពង្រឹងនៅក្នុង Tau441 (រូបភាព 5a, ព្រួញពណ៌ស)។ចំណុចទាំងនេះតែងតែត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងក្បូនក្នុងកម្រិតធំជាងសម្រាប់ αS/ΔNt-Tau ជាង αS/ΔNt-Tau ។មិនមានចំណុចជាក់លាក់ណាមួយនៅក្នុងដំណក់ទឹកនៃប្រព័ន្ធ pLK និង Tau ដែលមិនមានសមត្ថភាពក្នុងការលាយបញ្ចូលគ្នា/សើមនោះទេ។ដើម្បីសាកល្បងថាតើស្នាមប្រឡាក់ទាំងនេះដែលមាន αS និង Tau441 គឺជាការប្រមូលផ្តុំដូចអាមីឡូអ៊ីតដែរឬទេ យើងបានធ្វើការពិសោធន៍ស្រដៀងគ្នាដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ CF ដែល Tau441 ត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយ Atto647N និង 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) ត្រូវបានបន្ថែមតាំងពីដំបូង។លាបពណ៌ទោះបីជាស្នាមប្រឡាក់ ThT នៃ αS/Tau441 ដំណក់ទឹក ឬក្បូនមិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសូម្បីតែបន្ទាប់ពីការភ្ញាស់រយៈពេល 24 ម៉ោង (រូបភាព 5b ជួរកំពូល — ដំណក់ទឹកដែលនៅសល់លើក្បូនប្រូតេអ៊ីន) រចនាសម្ព័ន្ធ ThT-positive ដែលមាន Atto647N-Tau441 នៅខាងក្នុងក្បូនគឺខ្សោយណាស់។វាចម្លងទំហំ រូបរាង និងទីតាំងនៃចំណុចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (រូបភាពទី 5b ជួរកណ្តាល និងខាងក្រោម) ដែលបង្ហាញថាចំណុចអាចត្រូវគ្នាទៅនឹងការប្រមូលផ្តុំដូចអាមីឡូអ៊ីដ ដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុងសារធាតុទឹកដែលមានភាពចាស់។
WF 25 μM αS នៅពេលវេលាភ្ញាស់ផ្សេងៗ និងកម្ពស់ប្រសព្វ (z ចំងាយពីបាតមិនជាប់) ក្នុងវត្តមាន 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labeled αS និង Atto647N-labeled Tau441) នៅក្នុងអណ្តូងនៃចានមីក្រូទស្សន៍ជាមួយ LLPS buffer) .ការពិសោធន៍ចំនួនប្រាំមួយត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតដោយឯករាជ្យជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។b រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ CF នៃ 25 μM αS នៅក្នុងវត្តមាននៃ 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) និង 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ។តំណក់​ប្រូតេអ៊ីន​ដែល​មាន​ទម្ងន់ និង​ក្បូន​ប្រូតេអ៊ីន​ដែល​បាន​ដាក់ និង​ចំណុច​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​នៅ​ជួរ​ខាងលើ និង​កណ្តាល​រៀង​គ្នា។ជួរខាងក្រោមបង្ហាញរូបភាពនៃក្បូន និងដំណក់ទឹកពីអ្នកចម្លងឯករាជ្យចំនួន 3 ។ព្រួញពណ៌សបង្ហាញពីចំណុចវិជ្ជមាន ThT នៅក្នុងបន្ទះទាំងពីរ។របារមាត្រដ្ឋានសម្រាប់រូបភាពទាំងអស់គឺ 20 µm ។
ដើម្បីពិនិត្យមើលលម្អិតបន្ថែមទៀតអំពីការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន coacervate ក្នុងអំឡុងពេលផ្លាស់ប្តូរពីរាវទៅជារឹង យើងបានប្រើការថតរូបភាពពេញមួយជីវិត (FLIM) និងFörster resonance energy transfer microscopy (FRET) (រូបភាពទី 6 និងរូបភាពបន្ថែម 8 និង 9) ។យើងបានសន្មត់ថាភាពចាស់ទុំ coacervate នៃស្រទាប់ចូលទៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនសរុបដែលមានលក្ខណៈជា condensed ឬសូម្បីតែរឹង នាំឱ្យទំនាក់ទំនងកាន់តែជិតស្និទ្ធរវាងប្រូតេអ៊ីន និង fluorescent probe ដែលភ្ជាប់ជាមួយវា ដែលអាចបង្កើតឥទ្ធិពលពន្លត់ដែលបង្ហាញឱ្យឃើញក្នុងរយៈពេលខ្លីនៃអាយុកាលនៃការស៊ើបអង្កេត (τ) ដូចដែលបានរៀបរាប់ពីមុន 40 ។,41 ,42.លើសពីនេះទៀតសម្រាប់សំណាកដែលមានស្លាកពីរដង (AF488 និង Atto647N ជាអ្នកផ្តល់ FRET និងអ្នកទទួលថ្នាំជ្រលក់រៀងគ្នា) ការថយចុះនៃτនេះក៏អាចត្រូវបានអមដោយ coacervate condensation និងការកើនឡើងនៃប្រសិទ្ធភាព FRET(E) កំឡុងពេល LSPT ។យើងបានត្រួតពិនិត្យការបង្កើតក្បូន និងកន្លែងតាមពេលវេលានៅក្នុងគំរូ LLPS αS/Tau441 និង αS/ΔNt-Tau (25 µM នៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗនៅក្នុង LLPS buffer ដែលមាន 1 µM AF488 ដែលមានស្លាក αS និង/ឬ Atto647N ដែលមានស្លាក Tau441 ឬ ΔNt-Tau) ។យើងបានសង្កេតឃើញនិន្នាការទូទៅមួយនៅក្នុងនោះ អាយុកាលរបស់ហ្វ្លុយអូរីសនៃការស៊ើបអង្កេត AF488 (τ488) និង Atto647N (τ647N) បានថយចុះបន្តិចនៅពេលដែល coacervates ចាស់ទុំ (រូបភាពទី 6 និងរូបភាពបន្ថែម 8c) ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការផ្លាស់ប្តូរនេះត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងសម្រាប់ចំណុចនៅក្នុងក្បូន (រូបភាព 6c) ដែលបង្ហាញថាការខាប់ប្រូតេអ៊ីនបន្ថែមទៀតបានកើតឡើងនៅចំណុច។ក្នុងការជួយដល់ការនេះ គ្មានការផ្លាស់ប្តូរដ៏សំខាន់នៅក្នុងអាយុកាលរបស់ហ្វ្លុយអូរីសត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសម្រាប់ដំណក់ទឹក αS/ΔNt-Tau ដែលមានអាយុ 24 ម៉ោង (រូបភាពបន្ថែម 8 ឃ) ដែលបង្ហាញថាដំណក់ទឹក gelation គឺជាដំណើរការដែលខុសពីការប្រទះឃើញ ហើយនោះមិនត្រូវបានអមដោយការរៀបចំឡើងវិញនូវម៉ូលេគុលដ៏សំខាន់នោះទេ។ នៅក្នុង coacervates ។វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាចំណុចមានទំហំខុសៗគ្នា និងមាតិកាអថេរនៅក្នុងαS ជាពិសេសសម្រាប់ប្រព័ន្ធ αS/Tau441 (រូបភាពបន្ថែម 8e)។ការថយចុះនៃអាយុកាលរបស់ហ្វ្លុយអូរីសនៅនឹងកន្លែងត្រូវបានអមដោយការកើនឡើងនៃអាំងតង់ស៊ីតេ ជាពិសេសសម្រាប់ Atto647N ដែលមានស្លាក Tau441 (រូបភាពបន្ថែម 8a) និងប្រសិទ្ធភាព FRET ខ្ពស់ជាងសម្រាប់ប្រព័ន្ធ αS/Tau441 និង αS/ΔNt-Tau ដែលបង្ហាញពីការ condension បន្ថែមម៉ោងនៅក្នុង LL បន្ទាប់ពីការកេះ ប្រូតេអ៊ីននៅខាងក្នុងអគ្គិសនីឋិតិវន្តបានខាប់។បើប្រៀបធៀបទៅនឹង αS/ΔNt-Tau យើងបានសង្កេតឃើញតម្លៃ τ647N ទាបជាង និងតម្លៃ τ488 ខ្ពស់ជាងបន្តិចនៅក្នុងចំណុច αS/Tau441 អមដោយតម្លៃ FRET ទាប និងច្រើនដែលមិនស្មើគ្នា។ប្រហែលជា នេះអាចទាក់ទងទៅនឹងការពិតដែលថានៅក្នុងប្រព័ន្ធ αS/Tau441 ភាពសម្បូរបែប αS ដែលត្រូវបានអង្កេត និងរំពឹងទុកនៅក្នុងការប្រមូលផ្តុំគឺមានភាពខុសប្លែកគ្នាច្រើន ជាញឹកញាប់ substoichiometric បើប្រៀបធៀបទៅនឹង Tau ចាប់តាំងពី Tau441 ខ្លួនវាក៏អាចឆ្លងកាត់ LLPS និងការប្រមូលផ្តុំ (រូបភាពបន្ថែម 8e) .ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ កម្រិតនៃការបង្រួបបង្រួមនៃដំណក់ទឹក ការបង្កើតក្បូន និងសំខាន់ ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង coacervates ដូចរាវគឺអតិបរមានៅពេលដែលមានទាំង Tau441 និង αS ។
រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយវ៉េសពេញមួយជីវិត (FLIM) រូបភាពនៃ αS/Tau441 និង αS/ΔNt-Tau នៅ 25 μM នៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ (1 μM AF488-labeled αS និង 1 μM Atto647N-labeled Tau441 ឬ ΔNt-Taubuff) នៅក្នុង LLPSជួរ​ឈរ​បង្ហាញ​រូបភាព​តំណាង​នៃ​គំរូ LLPS នៅ​ពេល​កាលកំណត់​ផ្សេង​គ្នា (30 នាទី, 5 ម៉ោង និង 24 ម៉ោង)។ស៊ុមក្រហមបង្ហាញតំបន់ដែលមានចំណុច αS/Tau441 ។អាយុកាលត្រូវបានបង្ហាញជារបារពណ៌។របារមាត្រដ្ឋាន = 20 µm សម្រាប់រូបភាពទាំងអស់។b ពង្រីករូបភាព FLIM នៃផ្ទៃដែលបានជ្រើសរើស បង្ហាញក្នុងប្រអប់ក្រហមក្នុងបន្ទះ a.ជួរជីវិតត្រូវបានបង្ហាញដោយប្រើមាត្រដ្ឋានពណ៌ដូចគ្នានឹងនៅក្នុងបន្ទះ a ។របារមាត្រដ្ឋាន = 5 µm ។c អ៊ីស្តូក្រាមដែលបង្ហាញ AF488 (ភ្ជាប់ទៅ αS) ឬ Atto647N (ភ្ជាប់ជាមួយ Tau) សម្រាប់ប្រភេទប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នា (ដំណក់ទឹក-D-, raft-R- និង speckle-P) ដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងរូបភាព FLIM ដែលបានកត់ត្រាទុកសម្រាប់ αS-) ការចែកចាយពេលវេលាពេញមួយជីវិតរបស់ Tau441 និង αS/ΔNt-Tau coacervate សំណាក (N = 17-32 ROI សម្រាប់ D, 29-44 ROI សម្រាប់ R និង 21-51 ROI សម្រាប់ពិន្ទុ) ។តម្លៃមធ្យម និងមធ្យមត្រូវបានបង្ហាញជាការ៉េពណ៌លឿង និងបន្ទាត់ខ្មៅនៅខាងក្នុងប្រអប់រៀងៗខ្លួន។ព្រំដែនខាងក្រោម និងខាងលើនៃប្រអប់តំណាងឱ្យត្រីមាសទី 1 និងទី 3 រៀងគ្នា ហើយតម្លៃអប្បបរមា និងអតិបរមាក្នុងចន្លោះ 1.5 ដង (IQR) ត្រូវបានបង្ហាញជាវីស្គី។Outliers ត្រូវបានបង្ហាញជាពេជ្រខ្មៅ។សារៈសំខាន់ស្ថិតិរវាងគូនៃការចែកចាយត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើការធ្វើតេស្ត t-គំរូពីរ ដោយសន្មតថាមានការប្រែប្រួលមិនស្មើគ្នា។ការធ្វើតេស្ត p-values ​​កន្ទុយពីរត្រូវបានបង្ហាញដោយសញ្ញាផ្កាយសម្រាប់គូនីមួយៗនៃទិន្នន័យប្រៀបធៀប (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns បង្ហាញពីការធ្វេសប្រហែស (p-value > 0.05) ។តម្លៃ p ពិតប្រាកដត្រូវបានផ្តល់ឱ្យក្នុងតារាងបន្ថែម 1 ហើយទិន្នន័យដើមត្រូវបានបង្ហាញជាឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ដើម្បីបង្ហាញឱ្យឃើញបន្ថែមទៀតនូវលក្ខណៈដូចអាមីឡូអ៊ីដនៃ speckles/aggregates យើងបានព្យាបាលសំណាក coacervate ដែលមិនមានស្នាមប្រឡាក់រយៈពេល 24 ម៉ោងជាមួយនឹងកំហាប់ខ្ពស់នៃ (1 M) NaCl ដែលបណ្តាលឱ្យមានការបំបែកនៃប្រមូលផ្តុំពីប្រូតេអ៊ីន coacervates ។នៅពេលដែលការប្រមូលផ្តុំដាច់ឆ្ងាយ (ឧ. ដំណោះស្រាយដែលបែកខ្ចាត់ខ្ចាយនៃសារធាតុប្រមូលផ្តុំ) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍នៃកម្លាំងអាតូមិក (AFM) យើងបានសង្កេតឃើញរូបរាងរាងស្វ៊ែរលើសលុបដែលមានកម្ពស់ធម្មតាប្រហែល 15 nm ដែលមានទំនោរទាក់ទងគ្នាក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃកំហាប់អំបិលខ្ពស់ ស្រដៀងទៅនឹង ឥរិយាបថនៃសរសៃអាមីឡូអ៊ីតធម្មតា ដោយសារឥទ្ធិពលអ៊ីដ្រូហ្វូប៊ីកខ្លាំងលើផ្ទៃ (ចំណាំថាសរសៃអំបោះជាធម្មតាមានកម្ពស់ ~10 nm) (រូបភាពបន្ថែម 10a)។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ នៅពេលដែលសារធាតុចម្រុះដាច់ស្រយាលត្រូវបាន incubated ជាមួយ ThT នៅក្នុងការធ្វើតេស្ត fluorescence ThT ស្តង់ដារ យើងបានសង្កេតឃើញការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៃទិន្នផល fluorescence quantum ThT ដែលប្រៀបធៀបទៅនឹងអ្វីដែលបានសង្កេតឃើញនៅពេលដែលថ្នាំជ្រលក់ត្រូវបាន incubated ជាមួយ αS amyloid fibrils ធម្មតា (រូបភាពបន្ថែម 10b) ។ ការប្រមូលផ្តុំ coacervate មានរចនាសម្ព័ន្ធដូច amyloid ។.ជាការពិត សារធាតុផ្សំគឺមានភាពអត់ឱនចំពោះកំហាប់អំបិលខ្ពស់ ប៉ុន្តែមានភាពរសើបចំពោះ 4 M guanidine chloride (GdnHCl) ដូចជា amyloid fibrils ធម្មតា (រូបភាពបន្ថែម 10c)។
បន្ទាប់មកទៀត យើងបានវិភាគសមាសភាពនៃសារធាតុសរុបដោយប្រើ fluorescence ម៉ូលេគុលតែមួយ ការទាក់ទងគ្នានៃ fluorescence ជាក់លាក់/ការទាក់ទងគ្នាឆ្លង (FCS/FCCS) និងការវិភាគផ្ទុះនៃការរកឃើញចៃដន្យពីរពណ៌ (TCCD)។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ យើងបានញែកសារធាតុប្រមូលផ្តុំដែលបង្កើតឡើងបន្ទាប់ពីរយៈពេល 24 ម៉ោងនៃការភ្ញាស់ក្នុងគំរូ 100 μl LLPS ដែលមាន αS និង Tau441 (ទាំងពីរ 25 μM) រួមជាមួយ 1 μM AF488-labeled αS និង 1 μM Atto647N-labeled Tau441 ។ពនឺដំណោះស្រាយប្រមូលផ្តុំដែលបែកខ្ញែកជាលទ្ធផលទៅជារដ្ឋ monomolecular ដោយប្រើសតិបណ្ដោះអាសន្នគ្មាន PEG ដូចគ្នា និង 1 M NaCl (សតិបណ្ដោះអាសន្នដូចគ្នាដែលប្រើដើម្បីបំបែកការប្រមូលផ្តុំពី coacervate) ដើម្បីការពារអន្តរកម្មអគ្គិសនីដែលអាចកើតមានរវាង LLPS និងប្រូតេអ៊ីន។ឧទាហរណ៍នៃគន្លងពេលវេលានៃម៉ូលេគុលតែមួយអាចត្រូវបានគេមើលឃើញនៅក្នុងរូបភាពទី 7 ក។ការវិភាគ FCCS/FCS (ការជាប់ទាក់ទងគ្នា, CC និង autocorrelation, AC) បានបង្ហាញថាការប្រមូលផ្តុំដែលមាន αS និង tau មានច្រើននៅក្នុងគំរូ (សូមមើលខ្សែកោង CC ក្នុងរូបភាព 7b, បន្ទះខាងឆ្វេង) ហើយលើសនៃប្រូតេអ៊ីន monomeric ដែលនៅសល់បានកើតឡើងជា លទ្ធផលនៃដំណើរការរំលាយ (សូមមើលខ្សែកោង AC ក្នុងរូបភាពទី 7b បន្ទះខាងឆ្វេង)។ការពិសោធន៍ត្រួតពិនិត្យដែលបានធ្វើឡើងក្រោមលក្ខខណ្ឌដំណោះស្រាយដូចគ្នាដោយប្រើសំណាកដែលមានតែប្រូតេអ៊ីន monomeric បានបង្ហាញថាមិនមានខ្សែកោង CC ហើយខ្សែកោង AC សមល្អជាមួយគំរូនៃការសាយភាយសមាសធាតុតែមួយ (Eq. 4) ដែលប្រូតេអ៊ីន monomeric មានមេគុណនៃការសាយភាយដែលរំពឹងទុក (រូបភាព 7b ) បន្ទះខាងស្តាំ) ។មេគុណនៃការសាយភាយនៃភាគល្អិតសរុបគឺតិចជាង 1 µm2/s ហើយប្រូតេអ៊ីន monomeric គឺប្រហែល 1 µm2/s ។50-100 μm / s;តម្លៃគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងតម្លៃដែលបានបោះពុម្ពពីមុនសម្រាប់ sonicated αS amyloid fibrils និង monomeric αS ដាច់ដោយឡែកពីគ្នានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដំណោះស្រាយស្រដៀងគ្នា 44 ។នៅពេលដែលយើងវិភាគការប្រមូលផ្តុំជាមួយនឹងការវិភាគការផ្ទុះរបស់ TCCD (រូបភាព 7c, បន្ទះកំពូល) យើងបានរកឃើញថានៅក្នុងការប្រមូលផ្តុំដាច់ដោយឡែកនីមួយៗ (αS/Tau heteroaggregate) ប្រហែល 60% នៃសរុបដែលបានរកឃើញមានទាំង αS និង tau ប្រហែល 30% មានតែ tau ប្រហែល 10% αS ប៉ុណ្ណោះ។ការវិភាគ Stoichiometric នៃ αS/Tau heteroaggregates បានបង្ហាញថាភាគច្រើននៃ heteroaggregates ត្រូវបានសំបូរទៅដោយ tau (stoichiometry ក្រោម 0.5 ចំនួនមធ្យមនៃម៉ូលេគុល tau ក្នុងមួយសរុបគឺ 4 ដងច្រើនជាងម៉ូលេគុល αS) ដែលស្របនឹងការងាររបស់យើងដែលបានសង្កេតនៅក្នុង FLIM នៅកន្លែង។ ការពិសោធន៍។.ការវិភាគ FRET បានបង្ហាញថាការប្រមូលផ្តុំទាំងនេះមានប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរ ទោះបីជាតម្លៃ FRET ជាក់ស្តែងក្នុងករណីនេះមិនមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងក៏ដោយ ចាប់តាំងពីការចែកចាយ fluorophores នៅក្នុងការប្រមូលផ្តុំនីមួយៗគឺចៃដន្យដោយសារតែលើសនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមានស្លាកដែលត្រូវបានប្រើក្នុងការពិសោធន៍។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ នៅពេលដែលយើងធ្វើការវិភាគដូចគ្នាដោយប្រើវ៉ារ្យ៉ង់ 45,46 amyloid aggregation-deficient Tau ចាស់ទុំ (សូមមើលរូបភាពបន្ថែម 11a,b) យើងបានកត់សម្គាល់ថា ទោះបីជាការប្រមូលផ្តុំអេឡិចត្រូស្ទិក αS គឺដូចគ្នាក៏ដោយ (រូបភាពបន្ថែម 11c, d) សមត្ថភាពក្នុងការបង្កើតការប្រមូលផ្តុំនៅក្នុង coacervate ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង ហើយ FLIM បានរកឃើញចំណុចជាច្រើននៅក្នុងការពិសោធន៍កន្លែង ហើយខ្សែកោងទំនាក់ទំនងខ្សោយត្រូវបានអង្កេតឃើញសម្រាប់សំណាកសរុបដាច់ដោយឡែក។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សម្រាប់ចំនួនតូចមួយនៃការប្រមូលផ្តុំដែលបានរកឃើញ (ត្រឹមតែមួយភាគដប់នៃ Tau441) យើងបានសង្កេតឃើញថា សរុបនីមួយៗត្រូវបានសំបូរទៅដោយ αS ជាងវ៉ារ្យ៉ង់ Tau នេះ ដោយមានប្រហែល 50% នៃចំនួនសរុបដែលបានរកឃើញមានផ្ទុកតែ αS ម៉ូលេគុល ហើយ αS មានភាពខុសប្លែកគ្នាលើស .aggregates (សូមមើលរូបភពបន្ថែម 11e) ផ្ទុយទៅនឹងការប្រមូលផ្ដុំគ្នាដែលបង្កើតដោយ Tau441 (រូបភាព 6f)។លទ្ធផលនៃការពិសោធន៍ទាំងនេះបានបង្ហាញថា ទោះបីជា αS ខ្លួនវាមានសមត្ថភាពប្រមូលផ្តុំជាមួយ tau នៅក្នុង coacervate ក៏ដោយ ការ nucleation tau គឺមានភាពអំណោយផលជាងនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងនេះ ហើយការប្រមូលផ្តុំដូចអាមីឡូអ៊ីតជាលទ្ធផលអាចដើរតួជាទម្រង់ αS និង tau ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលដែលស្នូលដែលសំបូរទៅដោយ tau ត្រូវបានបង្កើតឡើង អន្តរកម្ម heterotypic រវាង αS និង tau ត្រូវបានពេញចិត្តក្នុងការប្រមូលផ្តុំលើអន្តរកម្ម homotypic រវាងម៉ូលេគុល tau ។យើងក៏សង្កេតមើលបណ្តាញប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងរាវ αS/tau coacervates ។
ដានបណ្ដោះអាសន្ន fluorescence តំណាងនៃម៉ូលេគុលតែមួយនៃសារធាតុប្រមូលផ្តុំដាច់ដោយឡែកដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុង αS/Tau441 coacervates អេឡិចត្រូស្ទិក។ការផ្ទុះដែលត្រូវគ្នាទៅនឹង αS/Tau441 coaggregates (ផ្ទុះលើសពីកម្រិតដែលបានបញ្ជាក់) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងបណ្តាញរាវរកចំនួនបី (ការបំភាយ AF488 និង Atto647N បន្ទាប់ពីការរំជើបរំជួលដោយផ្ទាល់ ខ្សែពណ៌ខៀវ និងក្រហម ការបំភាយ Atto647N បន្ទាប់ពីការរំភើបដោយប្រយោល), FRET, violet line)។b ការវិភាគ FCS/FCCS នៃគំរូនៃការប្រមូលផ្តុំ αS/Tau441 ដាច់ដោយឡែកដែលទទួលបានពី LLPS (បន្ទះខាងឆ្វេង)។ខ្សែកោង Autocorrelation (AC) សម្រាប់ AF488 និង Atto647N ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ខៀវ និងក្រហមរៀងៗខ្លួន ហើយខ្សែកោងនៃការជាប់ទាក់ទងគ្នា (CC) ដែលទាក់ទងនឹងការប្រមូលផ្តុំដែលមានសារធាតុពណ៌ទាំងពីរត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ស្វាយ។ខ្សែកោង AC ឆ្លុះបញ្ចាំងពីវត្តមានរបស់ប្រភេទប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកសញ្ញា monomeric និងសរុប ខណៈពេលដែលខ្សែកោង CC បង្ហាញតែការសាយភាយនៃចំនួនសរុបដែលមានស្លាកពីរប៉ុណ្ណោះ។ការវិភាគដូចគ្នា ប៉ុន្តែនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដំណោះស្រាយដូចគ្នានឹងកន្លែងដាច់ស្រយាល គំរូដែលមានតែ monomeric αS និង Tau441 ត្រូវបានបង្ហាញជាវត្ថុបញ្ជានៅក្នុងបន្ទះខាងស្តាំ។c ការវិភាគពន្លឺនៃពន្លឺនៃម៉ូលេគុលតែមួយនៃការប្រមូលផ្តុំដាច់ដោយឡែកដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុង αS/Tau441 coacervates អេឡិចត្រូស្ទិក។ព័ត៌មានសម្រាប់ការសរុបនីមួយៗដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការកើតឡើងម្តងទៀតចំនួនបួនផ្សេងគ្នា (N = 152) ត្រូវបានរៀបចំប្រឆាំងនឹង stoichiometry តម្លៃ S និងប្រសិទ្ធភាព FRET របស់ពួកគេ (បន្ទះខាងលើ របារពណ៌ឆ្លុះបញ្ចាំងពីការកើតឡើង)។ការប្រមូលផ្តុំបីប្រភេទអាចត្រូវបានសម្គាល់៖ -αS-សរុបរួមជាមួយ S~1 និង FRET~0, សរុប Tau-តែជាមួយ S~0 និង FRET~1, និងការបូកបញ្ចូលគ្នា Tau/αS ច្រើនជាមួយកម្រិតមធ្យម S និង FRET ការប៉ាន់ប្រមាណនៃចំនួនទឹកប្រាក់ នៃប្រូតេអ៊ីនសញ្ញាសម្គាល់ទាំងពីរដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការប្រមូលផ្ដុំគ្នា (N = 100) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងបន្ទះខាងក្រោម (មាត្រដ្ឋានពណ៌ឆ្លុះបញ្ចាំងពីការកើតឡើង) ។ទិន្នន័យឆៅត្រូវបានផ្តល់ជាទម្រង់ឯកសារទិន្នន័យឆៅ។
ភាពចាស់ទុំ ឬភាពចាស់នៃប្រូតេអ៊ីនរាវ condensates ទៅជារចនាសម្ព័ន្ធដូចជែល ឬរឹងតាមពេលវេលាត្រូវបានរាយការណ៍ថាពាក់ព័ន្ធនឹងមុខងារសរីរវិទ្យាជាច្រើននៃ condensate47 ក៏ដូចជានៅក្នុងជំងឺ ដែលជាដំណើរការមិនប្រក្រតីមុនការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីដ 7, 48, 49 ។ នៅទីនេះ យើងសិក្សាការបំបែកដំណាក់កាល និងអាកប្បកិរិយាលម្អិត។LSPT αS នៅក្នុងវត្តមាននៃ polycations ចៃដន្យនៅក្នុងបរិយាកាសដែលបានគ្រប់គ្រងនៅកំហាប់ micromolar ទាប និងលក្ខខណ្ឌពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យា (ចំណាំថាកំហាប់សរីរវិទ្យាដែលបានគណនានៃ αS គឺ> 1 µM50) ដោយធ្វើតាមឥរិយាបថដែលជំរុញដោយទែរម៉ូឌីណាមិកធម្មតានៃ LPS ។យើងបានរកឃើញថា αS ដែលមានតំបន់ C-terminal ដែលមានបន្ទុកអវិជ្ជមានខ្ពស់នៅ pH សរីរវិទ្យា អាចបង្កើតជាដំណក់ទឹកដែលសំបូរទៅដោយប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងដំណោះស្រាយ aqueous តាមរយៈ LLPS នៅក្នុងវត្តមាននៃ peptides ដែលរំខានដោយស៊ីតូស៊ីតខ្ពស់ដូចជា pLK ឬ Tau តាមរយៈដំណើរការនៃអេឡិចត្រូស្ទិក។ condensation ស្មុគស្មាញនៅក្នុងវត្តមាននៃ macromolecules ប្រមូលផ្តុំ។ដំណើរការនេះអាចមានឥទ្ធិពលពាក់ព័ន្ធនៅក្នុងបរិយាកាសកោសិកាដែល αS ជួបប្រទះនូវម៉ូលេគុល polycationic ជាច្រើនដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការប្រមូលផ្តុំដែលទាក់ទងនឹងជំងឺរបស់វាទាំងនៅក្នុង vitro និងនៅក្នុង vivo51,52,53,54។
នៅក្នុងការសិក្សាជាច្រើន ឌីណាមិកប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងដំណក់ទឹកត្រូវបានចាត់ទុកថាជាកត្តាសំខាន់មួយដែលកំណត់ដំណើរការនៃភាពចាស់ទុំ 55,56 ។នៅក្នុង electrostatic αS coacervates ជាមួយ polycations ដំណើរការនៃភាពចាស់ទុំជាក់ស្តែងអាស្រ័យលើភាពខ្លាំងនៃអន្តរកម្មជាមួយ polycations, valence និងពហុភាពនៃអន្តរកម្មទាំងនេះ។ទ្រឹស្ដីលំនឹងបង្ហាញថា លំនឹងនៃរដ្ឋរាវពីរនឹងមានវត្តមាននៃដំណក់ទឹកដ៏ធំមួយដែលសម្បូរទៅដោយជីវប៉ូលីម័រដែលជំរុញឱ្យ LLPS57,58 ។ការលូតលាស់របស់ដំណក់ទឹកអាចសម្រេចបានដោយភាពចាស់ទុំ Ostwald 59, coalescence60 ឬការប្រើប្រាស់ម៉ូណូម័រដោយឥតគិតថ្លៃក្នុងដំណាក់កាលទី 61 ដែលបែកខ្ញែក។សម្រាប់ αS និង Tau441, ΔNt-Tau ឬ pLK ប្រូតេអ៊ីនភាគច្រើនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំនៅក្នុង condensate ក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលបានប្រើក្នុងការសិក្សានេះ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ខណៈពេលដែលដំណក់ទឹក tau ពេញទំហំបានរួមផ្សំគ្នាយ៉ាងឆាប់រហ័សលើផ្ទៃសើម ការបង្រួបបង្រួមនៃដំណក់ទឹក និងការសើមគឺពិបាកសម្រាប់ ΔNt-Tau និង pLK ដែលបង្ហាញពីការបាត់បង់យ៉ាងឆាប់រហ័សនៃលក្ខណៈសម្បត្តិរាវនៅក្នុងប្រព័ន្ធទាំងពីរនេះ។យោងតាមការវិភាគ FLIM-FRET របស់យើង ដំណក់ទឹក pLK និង ΔNt-Tau ដែលមានវ័យចំណាស់បានបង្ហាញពីកម្រិតនៃការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនស្រដៀងគ្នា (អាយុកាលប្រហាក់ប្រហែលគ្នា) ជាដំណក់ទឹកដើម ដែលបង្ហាញថាបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនដើមត្រូវបានរក្សាទុក ទោះបីជារឹងជាងក៏ដោយ។
យើងវិភាគលទ្ធផលពិសោធន៍របស់យើងតាមគំរូខាងក្រោម (រូបភាពទី 8)។ដំណក់ទឹកដែលបានបង្កើតឡើងដំបូងជាបណ្ដោះអាសន្នជារឿយៗជាបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនដោយគ្មានសំណងអេឡិចត្រូស្តាត ដូច្នេះហើយមានតំបន់នៃអតុល្យភាពនៃបន្ទុក ជាពិសេសនៅចំនុចប្រទាក់ដំណក់ទឹក ដែលបណ្តាលឱ្យមានដំណក់ទឹកដែលមានសក្តានុពលលើផ្ទៃអេឡិចត្រិចខ្ពស់។ដើម្បីប៉ះប៉ូវបន្ទុក (បាតុភូតដែលជាទូទៅហៅថា valence depletion) និងកាត់បន្ថយសក្តានុពលលើផ្ទៃនៃដំណក់ទឹក ដំណក់ទឹកអាចរួមបញ្ចូល polypeptides ថ្មីពីដំណាក់កាល dilute រៀបចំបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនឡើងវិញដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពអន្តរកម្មបន្ទុក និងធ្វើអន្តរកម្មជាមួយដំណក់ទឹកផ្សេងទៀត។ជាមួយនឹងផ្ទៃ (សើម) ។ដំណក់ទឹក αS/pLK ដោយសារតែបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនសាមញ្ញជាងរបស់ពួកគេ (មានតែអន្តរកម្មតំណពូជរវាង αS និង pLK) និងភាពស្និទ្ធស្នាលកាន់តែខ្លាំងសម្រាប់អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន ហាក់ដូចជាអាចធ្វើឱ្យមានតុល្យភាពនៃបន្ទុកនៃ condensate កាន់តែលឿន។ជាការពិត យើងបានសង្កេតឃើញ kinetics ប្រូតេអ៊ីនលឿនជាងមុននៅក្នុង αS/pLK coacervates ដែលបង្កើតឡើងដំបូងជាង αS/Tau ។បន្ទាប់ពីការថយចុះនៃ valence អន្តរកម្មកាន់តែមានភាពច្របូកច្របល់ ហើយដំណក់ទឹកបាត់បង់លក្ខណៈសម្បត្តិរាវរបស់វា ហើយប្រែទៅជាដំណក់ទឹកដែលស្រដៀងនឹងជែល ដែលមិនងាយឆេះ ជាមួយនឹងសក្តានុពលនៃផ្ទៃអេឡិចត្រូតតិច (ហើយដូច្នេះមិនអាចសើមផ្ទៃ)។ផ្ទុយទៅវិញ ដំណក់ទឹក αS/Tau មិនសូវមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការធ្វើឱ្យសមតុល្យនៃបន្ទុករបស់ដំណក់ទឹកប្រសើរឡើងទេ ដោយសារបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនស្មុគស្មាញជាង (ជាមួយនឹងអន្តរកម្ម homotypic និង heterotypic) និងលក្ខណៈខ្សោយនៃអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន។នេះបណ្តាលឱ្យមានដំណក់ទឹកដែលរក្សាឥរិយាបទរាវសម្រាប់រយៈពេលបន្ត និងបង្ហាញសក្តានុពលផ្ទៃអេឡិចត្រូស្តាតខ្ពស់ ដែលទំនងជាត្រូវបានបង្រួមអប្បបរមាដោយការបង្រួបបង្រួម និងការរីកលូតលាស់ (ដូច្នេះកាត់បន្ថយផ្ទៃ/សមាមាត្របរិមាណនៃដំណក់ទឹក) និងដោយការសើមសារធាតុគីមីលើផ្ទៃ hydrophilic ។នេះបង្កើតបណ្ណាល័យប្រូតេអ៊ីនប្រមូលផ្តុំធំដែលរក្សាបាននូវលក្ខណៈសម្បត្តិនៃសារធាតុរាវ ខណៈដែលអន្តរកម្មនៅតែមានភាពបណ្តោះអាសន្នដោយសារតែការស្វែងរកថេរសម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការគិតប្រាក់នៅក្នុងបណ្តាញប្រូតេអ៊ីន។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ N-ទម្រង់កាត់ចុងក្រោយរបស់ Tau រួមទាំង isoforms62 ដែលកើតឡើងដោយធម្មជាតិ បង្ហាញអាកប្បកិរិយាកម្រិតមធ្យម ដោយខ្លះ coacervates aging ជាមួយ αS ទៅជាដំណក់ទឹកដូចជែលដែលមានអាយុកាលយូរ ខណៈពេលដែលអ្នកផ្សេងទៀតបំលែងទៅជា condensates រាវធំ។duality នេះនៅក្នុងភាពចាស់ទុំនៃ αS electrostatic coacervates គឺស្របជាមួយនឹងការសិក្សាទ្រឹស្តី និងពិសោធន៍ LLPS នាពេលថ្មីៗនេះ ដែលបានកំណត់ទំនាក់ទំនងរវាងការថយចុះនៃ valence និង electrostatic sieving នៅក្នុង condensates ដែលជាគន្លឹះក្នុងការគ្រប់គ្រងទំហំ condensate និងលក្ខណៈសម្បត្តិនៃសារធាតុរាវ។យន្តការ 58.61 ។
គ្រោងការណ៍នេះបង្ហាញពីផ្លូវប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីតដាក់សម្រាប់ αS និង Tau441 តាមរយៈ LLPS និង LSPT ។ជាមួយនឹងតំបន់ដែលសំបូរទៅដោយ anion (ក្រហម) និង cation-rich (ពណ៌ខៀវ) αS និង tau electrostatic coacervates ជាមួយនឹង valence ពេញចិត្តមានថាមពលលើផ្ទៃទាប ហើយដូច្នេះការ coalescence តិចជាង ដែលជាលទ្ធផលនៃភាពចាស់នៃដំណក់ទឹកយ៉ាងឆាប់រហ័ស។ស្ថានភាពជែលមិនប្រមូលផ្តុំស្ថិរភាពត្រូវបានសម្រេច។.ស្ថានភាពនេះគឺអំណោយផលខ្លាំងណាស់នៅក្នុងករណីនៃប្រព័ន្ធ αS/pLK ដោយសារតែភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់របស់វា និងបណ្តាញអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-គូដែលសាមញ្ញជាង ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរលឿនដូចជែល។ផ្ទុយទៅវិញ ដំណក់ទឹកដែលមាន valence មិនពេញចិត្ត ហើយដូច្នេះ តំបន់ដែលផ្ទុកដោយប្រូតេអ៊ីនដែលអាចរកបានសម្រាប់អន្តរកម្ម ធ្វើឱ្យវាកាន់តែងាយស្រួលសម្រាប់ coacervate ដើម្បី fuse និងសើមផ្ទៃ hydrophilic ដើម្បីកាត់បន្ថយថាមពលខ្ពស់របស់វា។ស្ថានភាពនេះគឺល្អសម្រាប់ αS/Tau441 coacervates ដែលមានបណ្តាញស្មុគស្មាញច្រើនដែលមានអន្តរកម្ម Tau-Tau និង αS-Tau ខ្សោយ។ផ្ទុយទៅវិញ សារធាតុ coacervates ធំជាងនឹងរក្សាបាននូវលក្ខណៈសម្បត្តិដូចសារធាតុរាវរបស់វា ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានអន្តរកម្មរវាងប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតកើតឡើង។ជាយថាហេតុ ការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីតខុសធម្មតាដែលមានទាំងទម្រង់ αS និង tau នៅក្នុងសារធាតុរាវ coacervate ដែលអាចទាក់ទងនឹងវត្ថុដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងអង្គធាតុបញ្ចូល ដែលជាសញ្ញានៃជំងឺសរសៃប្រសាទ។
រចនាសម្ព័ន្ធដូចអង្គធាតុរាវដ៏ធំដែលបង្កើតឡើងកំឡុងពេលចាស់ទុំនៃ αS/Tau441 ជាមួយនឹងបរិយាកាសប្រូតេអ៊ីនដែលមានការកកស្ទះខ្លាំង ប៉ុន្តែថាមវន្ត ហើយក្នុងកម្រិតតិចជាងនេះ αS/ΔNt-Tau coacervates គឺជាអាងស្តុកទឹកដ៏ល្អសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន។យើងពិតជាបានសង្កេតឃើញការបង្កើតនូវប្រូតេអ៊ីនដ៏រឹងមាំនៅក្នុងប្រភេទប្រូតេអ៊ីន coacervates ដែលជារឿយៗមានទាំង αS និង tau ។យើងបានបង្ហាញថា heteroaggregates ទាំងនេះមានស្ថេរភាពដោយអន្តរកម្មដែលមិនមែនជាអេឡិចត្រូស្ទិច អាចចងសារធាតុពណ៌ ThT ជាក់លាក់នៃអាមីឡូអ៊ីដតាមរបៀបដូចគ្នាទៅនឹងសរសៃអាមីឡូអ៊ីដធម្មតា ហើយពិតជាមានភាពធន់ទ្រាំស្រដៀងគ្នាទៅនឹងឥទ្ធិពលផ្សេងៗ។ការប្រមូលផ្តុំ αS/tau ដែលបង្កើតឡើងដោយ LLPS ត្រូវបានបង្ហាញថាមានលក្ខណៈសម្បត្តិដូចអាមីឡូអ៊ីត។ជាការពិត ការប្រែប្រួលចាស់ទុំនៃកង្វះ Tau ក្នុងការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីតត្រូវបានចុះខ្សោយយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងការបង្កើត αS ចម្រុះទាំងនេះនៅក្នុង coacervate អេឡិចត្រូតរាវ។ការកកើតនៃ αS/Tau441 aggregates ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញតែនៅខាងក្នុង coacervates ដែលរក្សាបាននូវលក្ខណៈសម្បត្តិដូចវត្ថុរាវ ហើយមិនដែលទេ ប្រសិនបើ coacervates/droplets មិនឈានដល់ស្ថានភាពជែល។ក្នុងករណីចុងក្រោយនេះ ការកើនឡើងនៃកម្លាំងនៃអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាត ហើយជាលទ្ធផល ភាពរឹងនៃបណ្តាញប្រូតេអ៊ីនរារាំងការរៀបចំឡើងវិញនៃប្រូតេអ៊ីនដែលចាំបាច់ដើម្បីបង្កើតអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនថ្មីដែលចាំបាច់សម្រាប់ការបង្កើត nucleation អាមីឡូអ៊ីត។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នេះអាចសម្រេចបាននៅក្នុង coacervates ដូចរាវដែលអាចបត់បែនបាន ដែលនៅក្នុងវេនទំនងជានៅតែរាវនៅពេលដែលវាកើនឡើងនៅក្នុងទំហំ។
ការពិតដែលថាការបង្កើតការប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងដំណាក់កាល condensed គឺល្អជាងនៅក្នុង αS/Tau condensates ធំជាងនៅក្នុងដំណក់ទឹកតូចៗដែលរហ័ស gel បញ្ជាក់ពីភាពពាក់ព័ន្ធនៃការកំណត់អត្តសញ្ញាណកត្តាដែលគ្រប់គ្រងការបង្រួបបង្រួមនៃដំណក់ទឹក។ដូច្នេះមិនត្រឹមតែមានទំនោរសម្រាប់ការបំបែកដំណាក់កាលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែទំហំនៃ condensate ត្រូវតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងសម្រាប់ដំណើរការត្រឹមត្រូវក៏ដូចជាការការពារជំងឺ 58,61 ។លទ្ធផលរបស់យើងក៏បញ្ជាក់ពីសារៈសំខាន់នៃតុល្យភាពរវាង LLPS និង LSPT សម្រាប់ប្រព័ន្ធαS/Tau។ខណៈពេលដែលការបង្កើតដំណក់ទឹកអាចការពារប្រឆាំងនឹងការប្រមូលផ្តុំអាមីឡូអ៊ីដដោយកាត់បន្ថយបរិមាណម៉ូណូម័រប្រូតេអ៊ីនដែលមាននៅក្រោមលក្ខខណ្ឌតិត្ថិភាព ដូចដែលត្រូវបានស្នើឡើងនៅក្នុងប្រព័ន្ធផ្សេងទៀត63,64 ការលាយដំណក់ទឹកនៅកម្រិតដំណក់ទឹកខ្ពស់អាចនាំទៅរកការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនខាងក្នុងតាមរយៈការរៀបចំឡើងវិញនៃទម្រង់យឺត។បណ្តាញប្រូតេអ៊ីន។.
សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងសង្កត់ធ្ងន់យ៉ាងខ្លាំងទៅលើភាពពាក់ព័ន្ធនៃវ៉ាឡង់ដ៏ស្អិតរមួត និងអន្តរកម្មដែលពេញចិត្ត/មិនពេញចិត្តនៅក្នុងបណ្តាញធ្លាក់ចុះនៅក្នុងបរិបទនៃ LSPT ។ជាពិសេស យើងបង្ហាញថា αS/Tau441 condensates ប្រវែងពេញអាចបំប្លែង និង nucleate ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពដើម្បីបង្កើតជា heteroaggregates ស្រដៀងនឹង amyloid ដែលរួមមានទាំងប្រូតេអ៊ីន និងស្នើយន្តការម៉ូលេគុលដោយផ្អែកលើលទ្ធផលពិសោធន៍របស់យើង។ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនពីរនៅក្នុង αS/Tau fluid coacervate ដែលយើងរាយការណ៍នៅទីនេះពិតជាអាចទាក់ទងទៅនឹងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនពីរនៅក្នុងការរួមបញ្ចូល ដែលជាសញ្ញានៃជំងឺ ហើយអាចរួមចំណែកដល់ការយល់ដឹងពីទំនាក់ទំនងរវាង LLPS និង ការប្រមូលផ្តុំ amyloid ដែលត្រួសត្រាយផ្លូវសម្រាប់ IDP ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង neurodegeneration ។
Monomeric WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) និង ΔCt-αS វ៉ារ្យ៉ង់ (Δ101-140) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង E. coli និងបន្សុតដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។5 mM DTT ត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងជំហានទាំងអស់ក្នុងការបន្សុតនៃ αS cysteine ​​mutants ដើម្បីការពារការបង្កើតចំណង disulfide ។Tau441 isoform (plasmid ទទួលបានពី Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, ទទួលបានដោយការក្លូន IVA ជាមួយ primers CTTTAAGAAGGAGAATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) និង Aggpured-1TCACTau variant (ET5r5) វប្បធម៌ coli ត្រូវបាន លូតលាស់ដល់ OD600 = 0.6–0.7 នៅ 37°C និង 180 rpm ហើយការបញ្ចេញមតិត្រូវបានជំរុញដោយ IPTG រយៈពេល 3 ម៉ោងនៅ 37°C។ប្រមូលផលកោសិកានៅកម្រិត 11,500 xg រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4 °C ហើយលាងសម្អាតដោយសារធាតុអំបិលដែលមានផ្ទុក 150 mM NaCl ។ផ្អាក​គ្រាប់​ឡើងវិញ​ក្នុង​សតិបណ្ដោះ​អាសន្ន​លីហ្សីស (20 មីលីលីត្រ​ក្នុង​មួយ​លីត្រ 1 លីប៊ី៖ MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM10pcope) ។ជំហាន sonication ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើទឹកកកជាមួយនឹងទំហំ 80% សម្រាប់ 10 pulses (1 នាទីនៅលើ, 1 នាទីបិទ) ។កុំលើសពី 60 មីលីលីត្រក្នុងមួយអ៊ុលត្រាសោន។E. coli lysates ត្រូវបានកំដៅនៅ 95 ° C. សម្រាប់រយៈពេល 20 នាទី បន្ទាប់មកត្រជាក់នៅលើទឹកកក និង centrifuged នៅ 127,000 × g រយៈពេល 40 នាទី។សារធាតុ supernatant ដែលត្រូវបានបញ្ជាក់ត្រូវបានគេអនុវត្តទៅលើភ្នាស 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) និងបានធ្វើការលាងជម្រះប្រឆាំងនឹង 4 L នៃ dialysis buffer (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT , PMSF 0.1 mM) រយៈពេល 10 ម៉ោង។ជួរឈរផ្លាស់ប្តូរ cation 5 មីលីលីត្រ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, សហរដ្ឋអាមេរិក) ត្រូវបានរក្សាលំនឹងជាមួយសតិបណ្ដោះអាសន្ន (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, SF) 0.1 mMសារធាតុ tau lysate ត្រូវបានច្រោះតាមរយៈតម្រង PVDF 0.22 μm ហើយចាក់ចូលទៅក្នុងជួរឈរក្នុងអត្រាលំហូរ 1 មីលីលីត្រ / នាទី។Elution ត្រូវបានអនុវត្តជាបណ្តើរៗ, tau ត្រូវបាន eluted ជាមួយ elution buffer 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ។ប្រភាគត្រូវបានវិភាគដោយ SDS-PAGE ហើយប្រភាគណាមួយដែលមានក្រុមតន្រ្តីមួយជាមួយនឹងទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលរំពឹងទុកនៃ tau ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយប្រើតម្រង 10 kDa centrifuge ហើយជំនួសដោយទ្រនាប់ដែលមានផ្ទុក 10 mM HEPES pH 7.4 NaCl 500 mM និង DTT 2 mM សម្រាប់ កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនចុងក្រោយគឺ 100 μM។បន្ទាប់មក សូលុយស្យុងប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានឆ្លងកាត់តម្រង PVDF 0.22 μm កកយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងរក្សាទុកនៅ -80 ° C ។ប្រូតេអ៊ីន K18 ត្រូវបានផ្តល់ដោយសាស្ត្រាចារ្យ Alberto Boffi ។ភាពបរិសុទ្ធនៃការរៀបចំគឺ> 95% ដូចដែលបានបញ្ជាក់ដោយ SDS-PAGE និង MALDI-TOF/TOF ។cysteine ​​ជាច្រើនត្រូវបានដាក់ស្លាកគីមីជាមួយ AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ឬ TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)។ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការស្រូបយកនិង MALDI-TOF/TOF ។Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau និង K18 ត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយសំណល់ cysteine ​​​​ដើមនៅទីតាំង 191 និង 322 ដោយប្រើ Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) តាមនីតិវិធីដូចគ្នា។ការគិតថ្លៃសុទ្ធក្នុងមួយផែនទីសំណល់សម្រាប់ αS និង Tau441 ត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើ CIDER66 ។
Poly-L-lysine រឹង (pLK DP 90-110 យោងតាម ​​NMR ពីអ្នកផ្គត់ផ្គង់ Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ទៅ 10 mM កំហាប់ដំណើរការ sonicated សម្រាប់ 5 នាទីនៅក្នុងអាងងូតទឹក ultrasonic និងរក្សាទុកនៅ -20 ° C ។PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) និង FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) គឺជាសារធាតុរលាយក្នុងទឹក និងចែកចាយយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុង LLPS buffer។ការលាងឈាម យកអំបិលកខ្វក់ចេញ។បន្ទាប់មកពួកគេត្រូវបានច្រោះតាមរយៈតម្រងសឺរាុំងដែលមានទំហំរន្ធញើស 0.22 μm ហើយកំហាប់របស់ពួកវាត្រូវបានគណនាដោយប្រើឧបករណ៍ refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA)។សំណាក LLPS ត្រូវបានរៀបចំនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់តាមលំដាប់ដូចខាងក្រោមៈ សតិបណ្ដោះអាសន្ន និងការបញ្ចោញត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នា និង 1 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) អាស៊ីត tetraacetic (EDTA, carboxynth) និងល្បាយនៃ 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) ។បន្ទាប់មក αS និង fused polycations (ជម្រើស pLK ឬ Tau) ត្រូវបានបន្ថែម។សម្រាប់ការពិសោធន៍ស៊េរីពេលវេលា thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, ចក្រភពអង់គ្លេស) ប្រើកំហាប់ ThT សរុបទៅជាពាក់កណ្តាលនៃកំហាប់αS។លាយសំណាកដោយថ្នមៗ ប៉ុន្តែយ៉ាងហ្មត់ចត់ ដើម្បីធានាថាវាមានភាពដូចគ្នា។ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃសមាសធាតុនីមួយៗប្រែប្រួលពីការពិសោធន៍មួយទៅការពិសោធន៍ ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងផ្នែកលទ្ធផល។Azide ត្រូវបានគេប្រើនៅកំហាប់ 0.02% (w/v) នៅពេលដែលរយៈពេលនៃការពិសោធន៍លើសពី 4 ម៉ោង។សម្រាប់ការវិភាគទាំងអស់ដោយប្រើសំណាក LLPS អនុញ្ញាតឱ្យល្បាយមានតុល្យភាពរយៈពេល 5 នាទីមុនពេលវិភាគ។សម្រាប់ការវិភាគលើការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺ គំរូ 150 µl ត្រូវបានផ្ទុកទៅលើមីក្រូផ្លាត 96 អណ្តូងដែលមិនចងភ្ជាប់ (µClear®, ខ្មៅ, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, អូទ្រីស) និងគ្របដណ្តប់ដោយខ្សែភាពយន្ត adhesive ។LLPs ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយការវាស់ស្ទង់ការស្រូបយកនៅ 350 nm នៅកណ្តាលនៃដំណោះស្រាយនៅក្នុងឧបករណ៍អានចាន CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) ។ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើឡើងជាបីដងនៅសីតុណ្ហភាព 25°C ហើយកំហុសត្រូវបានគណនាជាគម្លាតស្តង់ដារពីមធ្យម។ដំណាក់កាល dilute ត្រូវបានគណនាដោយ centrifugation គំរូ និងការវិភាគជែល SDS-PAGE ហើយប្រភាគ αS នៅក្នុងដំណាក់កាល dilute និង ប្រមូលផ្តុំត្រូវបានគណនាបរិមាណនៅក្នុងដំណោះស្រាយ LLPS ផ្សេងៗ។គំរូ LLPS 100 μl ដែលមាន 1 μM AF488-labelated αS ត្រូវបានរៀបចំដោយការលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងល្អិតល្អន់ អមដោយ centrifugation នៅ 9600 × g សម្រាប់រយៈពេល 30 នាទី បន្ទាប់មកទឹកភ្លៀងជាធម្មតាអាចមើលឃើញ។កំពូល 50 μlនៃ supernatant ត្រូវបានប្រើសម្រាប់បរិមាណប្រូតេអ៊ីនដោយប្រើជែល SDS-PAGE ។ជែលត្រូវបានស្កេនជាមួយនឹងតម្រង AF488 ដោយប្រើប្រព័ន្ធរូបភាពជែល ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ឬប្រឡាក់ដោយស្នាមប្រឡាក់ Coomassie និងមើលឃើញជាមួយនឹងតម្រងសមស្រប។ក្រុមតន្រ្តីលទ្ធផលត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ ImageJ កំណែ 1.53i (វិទ្យាស្ថានសុខភាពជាតិ សហរដ្ឋអាមេរិក)។ការ​ពិសោធន៍​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឡើង​ស្ទួន​ក្នុង​ការ​ពិសោធន៍​ពីរ​ផ្សេង​គ្នា​ដែល​មាន​លទ្ធផល​ស្រដៀង​គ្នា។
ជាធម្មតា 150 μl នៃសំណាកត្រូវបានអនុវត្តទៅមីក្រូចាន 96 អណ្តូងដែលមិនចងភ្ជាប់ និងមើលឃើញនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់នៅលើមីក្រូទស្សន៍បញ្ច្រាស Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ។សម្រាប់ការពិសោធន៍កន្លែងនោះ ចាន µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ឬ 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ក៏ត្រូវបានប្រើប្រាស់ផងដែរ។EL6000 halogen ឬចង្កៀង halide ដែកបារតត្រូវបានប្រើជាប្រភពបំភ្លឺ (សម្រាប់រូបភាព BF/DIC និង WF រៀងគ្នា) ។សម្រាប់មីក្រូទស្សន៍ WF គោលបំណងខ្យល់ពង្រីក 40x (Leica Microsystems ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) ត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្តោតពន្លឺលើគំរូ និងប្រមូលវា។សម្រាប់សំណាកដែលមានស្លាក AF488 និង ThT តម្រងការរំភើបចិត្ត និងការបំភាយជាមួយនឹងសំណុំតម្រង GFP ស្តង់ដារ តម្រងការរំភើប និងការបំភាយ bandpass រៀងគ្នា តម្រង bandpass 460–500 nm និង 512–542 nm និងកញ្ចក់ dichroic 495 nm ។សម្រាប់សំណាកដែលដាក់ស្លាកជាមួយ Atto647N សំណុំស្តង់ដារនៃតម្រង Cy5 ជាមួយនឹងតម្រងការរំភើប និងការបំភាយ bandpass 628–40 nm និង 692–40 nm រៀងគ្នា និងកញ្ចក់ dichroic 660 nm ត្រូវបានប្រើប្រាស់។សម្រាប់មីក្រូទស្សន៍ BF និង DIC ប្រើគោលបំណងប្រមូលពន្លឺដែលឆ្លុះបញ្ចាំងដូចគ្នា។ពន្លឺដែលប្រមូលបានត្រូវបានថតនៅលើកាមេរ៉ា Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់)។ពេលវេលានៃការប៉ះពាល់គឺ 50 ms សម្រាប់រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ BF និង DIC និង 20-100 ms សម្រាប់រូបភាពមីក្រូទស្សន៍ WF ។សម្រាប់ការប្រៀបធៀប ពេលវេលាបង្ហាញសម្រាប់ការពិសោធន៍ទាំងអស់ជាមួយ ThT គឺ 100 ms ។ការពិសោធន៍តាមពេលវេលាត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីមើលរូបភាពនៃតំណក់តូចៗ ដោយរូបភាពត្រូវបានប្រមូលរៀងរាល់ 100 ms រយៈពេលជាច្រើននាទី។ImageJ (NIH សហរដ្ឋអាមេរិក) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគរូបភាព។ការពិសោធន៍ត្រូវបានអនុវត្តជាបីដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
សម្រាប់ការពិសោធន៍ colocalization ការកសាងឡើងវិញ FRAP និង 3D រូបភាពត្រូវបានទទួលនៅលើមីក្រូទស្សន៍ដាក់បញ្ច្រាស Zeiss LSM 880 ដោយប្រើ ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)។គំរូ 50 µl ត្រូវបានអនុវត្តចំពោះចាន µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany) ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយសារធាតុប៉ូលីម៊ែរអ៊ីដ្រូហ្វីលីក (ibiTreat) និងបានតំឡើងក្នុងគោលបំណងពន្លិចប្រេង 63 × (Plan-Apochromat 63 ×/NA 1.4 Oil) នៅលើ DIC) ។រូបភាពត្រូវបានទទួលដោយប្រើ 458 nm, 488 nm, និង 633 nm argon laser line with a resolution of 0.26 µm/pixel និង exposure time of 8 µs/pixel សម្រាប់ការរំភើប និង emission windows detection of 470-600 nm, 493-628 nm និង 638-755 nm ត្រូវបានប្រើដើម្បីមើលឃើញ ThT, AF488 និង Atto647N រៀងគ្នា។សម្រាប់ការពិសោធន៍ FRAP ការថតរូបតាមពេលវេលានៃគំរូនីមួយៗត្រូវបានកត់ត្រាក្នុងល្បឿន 1 ហ្វ្រេមក្នុងមួយវិនាទី។ការពិសោធន៍ត្រូវបានអនុវត្តជាបីដងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។រូបភាពទាំងអស់ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើកម្មវិធី Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)។ខ្សែកោង FRAP ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឱ្យ​មាន​លក្ខណៈ​ធម្មតា គ្រោង និង​សម​នឹង​ទិន្នន័យ​កម្រិត/ពេលវេលា​ដែល​បាន​ស្រង់​ចេញ​ពី​រូបភាព​ដោយ​ប្រើ Zen 2 ដោយ​ប្រើ OriginPro 9.1។ខ្សែកោងនៃការងើបឡើងវិញត្រូវបានបំពាក់ទៅនឹងគំរូអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល mono-exponential ដើម្បីគណនាការសាយភាយម៉ូលេគុលជាមួយនឹងពាក្យអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលបន្ថែម ដើម្បីគណនាប្រសិទ្ធភាពនៃការទទួលបាន bleaching ។បន្ទាប់មកយើងគណនា D ដោយប្រើកាំ bleaching នាមករណ៍ និងពាក់កណ្តាលជីវិតដែលបានកំណត់ពីមុន ដូចនៅក្នុងសមីការនៃ Kang et al ។5 35 បង្ហាញ។
វ៉ារ្យ៉ង់ cysteine ​​​​តែមួយនៃαSត្រូវបានសំយោគជាមួយ 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) នៅទីតាំង 24 (TEMPOL-24-αS) និង 122 (TEMPOL-122-αS), រៀងៗខ្លួន។Spin Labeling សម្រាប់ការពិសោធន៍ EPR កំហាប់αS ត្រូវបានកំណត់នៅ 100 μM ហើយកំហាប់ PEG គឺ 15% (w/v)។សម្រាប់លក្ខខណ្ឌនៃការប្រមូលផ្តុំផ្សេងៗ សមាមាត្រ αS:pLK គឺ 1:10 ខណៈពេលដែលសមាមាត្រ αS:ΔNt-Tau និង αS:Tau441 ត្រូវបានរក្សានៅ 1:1។សម្រាប់ការពិសោធន៍ titration ចងនៅក្នុងការអវត្ដមាននៃហ្វូងមនុស្ស TEMPOL-122-αS ត្រូវបានរក្សានៅ 50 μM ហើយ polycations ត្រូវបាន titrated នៅការកើនឡើងកំហាប់ ដោយរៀបចំលក្ខខណ្ឌនីមួយៗដោយឡែកពីគ្នា។ការវាស់វែង CW-EPR ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ Bruker ELEXSYS E580 X-band បំពាក់ដោយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា Bruker ER4118 SPT-N1 ដែលដំណើរការនៅប្រេកង់មីក្រូវ៉េវ (SHF) នៃ ~ 9.7 GHz ។សីតុណ្ហភាពត្រូវបានកំណត់នៅ 25 ° C និងគ្រប់គ្រងដោយ cryostat អាសូតរាវ។វិសាលគមត្រូវបានទទួលនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌមិនឆ្អែតនៅថាមពល MW នៃ 4 mW អំព្លីទីតម៉ូឌុលនៃ 0.1 mT និងប្រេកង់ម៉ូឌុលនៃ 100 kHz ។អាំងតង់ស៊ីតេនៃវិសាលគមត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដើម្បីជៀសវាងភាពខុសគ្នានៃកំហាប់វិលរវាងគំរូ និងការកាត់បន្ថយការបង្វិលដែលអាចកើតមានដោយសារតែការប្រមូលផ្តុំសំណល់នៃភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយនៅក្នុងគំរូដែលមាន Tau441 ឬ ΔNt-Tau (មាននៅក្នុងដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីនដើម) ។តម្លៃដែលបានផ្តល់ឱ្យនៃ g ត្រូវបានគេទទួលបានជាលទ្ធផលនៃការធ្វើគំរូវិសាលគម EPR ដែលត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) ដែលបានអនុវត្តនៅក្នុងMatlab®67។គំរូ isotropic សមាសភាគមួយ/ពីរត្រូវបានប្រើដើម្បីធ្វើគំរូទិន្នន័យ។បន្ទាប់ពីធ្វើឱ្យសញ្ញាទាំងអស់មានលក្ខណៈធម្មតា សំណល់ត្រូវបានគណនាដោយដកការក្លែងធ្វើនីមួយៗចេញពីវិសាលគមពិសោធន៍ដែលត្រូវគ្នា។សម្រាប់ការវិភាគ titration ការចង អាំងតង់ស៊ីតេដែលទាក់ទងនៃក្រុមទី 3 ទៅក្រុមទីពីរនៃវិសាលគម EPR ធម្មតា (IIII/III) ត្រូវបានប្រើដើម្បីតាមដានការចងនៃ polycations ទៅ αS ។ដើម្បីប៉ាន់ប្រមាណតម្លៃថេរ dissociation (Kd) ខ្សែកោងលទ្ធផលត្រូវបានបំពាក់ទៅនឹងគំរូប្រហាក់ប្រហែលដែលសន្មត់ថា n ទីតាំងចងដូចគ្នា និងឯករាជ្យ។
ការពិសោធន៍ NMR spectroscopy ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer ដែលបំពាក់ដោយ cryoprobe និង Z-gradient ។ការពិសោធន៍ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ 130–207 µM αS និង αS/ΔNt-Tau និង pLK ដែលត្រូវគ្នាក្នុង 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 និងត្រូវបានអនុវត្តនៅ 15 ° C ។ដើម្បីតាមដាន LPS ដោយ NMR 10% PEG ត្រូវបានបន្ថែមទៅសំណាកមុនលាយ។ផែនការបំរែបំរួលនៃការផ្លាស់ប្តូរគីមី (រូបភាព 1b) បង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរគីមី 1H និង 15N ជាមធ្យម។វិសាលគម αS 2D1H-15N HSQC ត្រូវបានចាត់តាំងដោយផ្អែកលើការចាត់តាំងពីមុន (ធាតុ BMRB #25227) ហើយបញ្ជាក់ដោយការថត និងវិភាគវិសាលគម 3D នៃ HNCA, HNCO និង CCBCAcoNH ។ការផ្លាស់ប្តូរគីមី 13Cα និង 13Cβ ត្រូវបានគណនានៅក្នុងវត្តមាននៃ ΔNt-Tau ឬ pLK ដើម្បីវាស់វែងការផ្លាស់ប្តូរដែលអាចកើតមាននៅក្នុងនិន្នាការរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរគីមី αS នៅក្នុងការអនុលោមភាពចៃដន្យសុទ្ធ 68 (រូបភាពបន្ថែម 5c) ។អត្រា R1ρ ត្រូវបានវាស់ដោយការកត់ត្រាការពិសោធន៍ hsqctretf3gpsi (ទទួលបានពីបណ្ណាល័យ Bruker) ដោយមានការពន្យារពេល 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 និង 800 ms ហើយមុខងារអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលត្រូវបានកែតម្រូវទៅកម្រិតអតិបរមានៃការពន្យាពេលខុសៗគ្នា។ ដងដើម្បីកំណត់ R1ρ និងភាពមិនច្បាស់លាស់នៃការពិសោធន៍របស់វា។
ការពិសោធន៍មីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយវ៉េសដែលបានដោះស្រាយពេលវេលាពីរពណ៌ត្រូវបានអនុវត្តលើមីក្រូទស្សន៍ MT200 ដែលត្រូវបានដោះស្រាយតាមពេលវេលាពាណិជ្ជកម្ម (PicoQuant, Berlin, Germany) ជាមួយនឹងឧបករណ៍រាប់ចំនួន photon តែមួយដែលទាក់ទងគ្នាតាមពេលវេលា (TCSPC)។ក្បាល diode ឡាស៊ែរត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការរំភើបចិត្ត interleaved ជីពចរ (PIE) ធ្នឹមឆ្លងកាត់ waveguide របៀបតែមួយ និងត្រូវបានលៃតម្រូវទៅជាថាមពលឡាស៊ែរពី 10 ទៅ 100 nW សម្រាប់ 481 nm និង 637 nm បន្ទាត់ឡាស៊ែរដែលវាស់វែងបន្ទាប់ពីកញ្ចក់ឌីគ្រីប។នេះធានាបាននូវអត្រានៃការរាប់ចំនួន photon ដ៏ល្អប្រសើរ ជៀសវាងផលប៉ះពាល់នៃ photon aliasing, photobleaching និង saturation។μ-Slide angiogenesis coverlips ឬ plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ត្រូវបានដាក់ដោយផ្ទាល់នៅក្នុងទឹកដែលជ្រមុជលើកញ្ចក់ Super Apochromat 60x NA 1.2 ជាមួយនឹងកអាវកែ (Olympus Life Sciences, Waltham, USA)។កញ្ចក់ dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ត្រូវបានគេប្រើជាអ្នកបំបែកធ្នឹមសំខាន់។វិទ្យុសកម្មដែលមិនផ្តោតអារម្មណ៍ត្រូវបានរារាំងដោយរន្ធដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 50 មីរ៉ូ បន្ទាប់មកវិទ្យុសកម្មផ្តោតត្រូវបានបែងចែកទៅជា 2 ផ្លូវរាវរកដោយឧបករណ៍បំបែកធ្នឹម 50/50 ។តម្រងបំភាយ Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 សម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌បៃតង (AF488) និង 690/70 សម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌ក្រហម (Atto647N) ត្រូវបានប្រើនៅពីមុខឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា។ឌីយ៉ូដ avalanche avalanche តែមួយ (SPAD) (ឧបករណ៍មីក្រូ Photon, Bolzano, អ៊ីតាលី) ត្រូវបានប្រើជាឧបករណ៍រាវរក។ទាំងការប្រមូលទិន្នន័យ និងការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី SymphoTime64 ដែលមានពាណិជ្ជកម្ម (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany)។
ហាសិបមីក្រូលីត្រនៃសំណាក LLPS ត្រូវបានអនុវត្តទៅអណ្តូង μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany)។រូបភាពលទ្ធផលត្រូវបានផ្តោតទៅ 20 µm ពីលើបាតអណ្តូងសម្រាប់ចម្ងាយការងារល្អបំផុតសម្រាប់ដំណក់ទឹកដែលផ្អាក និងដល់ ~1 µm សម្រាប់ក្បូន និងចំនុចដែលមានដំណោះស្រាយអ័ក្សយ៉ាងហោចណាស់ 0.25 µm/pixel និងពេលវេលាពន្យាពេល 400 µs/pixel ។ជ្រើសរើសទិន្នន័យដោយអនុវត្តកម្រិតអាំងតង់ស៊ីតេដោយផ្អែកលើអាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយជាមធ្យម (PBG, mean + 2σ) សម្រាប់ប៉ុស្តិ៍នីមួយៗ ដូច្នេះមានតែដំណក់ប្រូតេអ៊ីនរាវ ក្បូន ឬចំណុចប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានជ្រើសរើស ដោយត្រងចេញនូវប្រភពដើមដែលអាចកើតមានពីដំណាក់កាលបែកខ្ញែក។ដើម្បីវិភាគអាយុកាលនៃប្រភេទសត្វនីមួយៗ (τ) នៃឆានែលនីមួយៗ (ពណ៌បៃតង “g” សម្រាប់ AF488 និងពណ៌ក្រហម “r” សម្រាប់ Atto647N) យើងបានជ្រើសរើសតំបន់ដែលចាប់អារម្មណ៍ (ROIs) ដែលមានដំណក់ទឹក ក្បូន ឬកន្លែងផ្សេងៗ (រូបភាពបន្ថែម 1 )8b) និងទទួលបានពួកវាដោយសមទៅនឹងការពុកផុយពេញមួយជីវិតរបស់ពួកគេ (τD, τR និង τP សម្រាប់ដំណក់ទឹក ក្បូន ឬចំណុចរៀងៗខ្លួន សូមមើលរូបបន្ថែម 8c) នៅក្នុងឆានែលនីមួយៗដោយប្រើការវិភាគផ្នែកកន្ទុយ និងគំរូការពុកផុយពីរផ្នែក។ជាមធ្យម τ ពី τ ។ROIs ដែលផលិត photons តិចពេកសម្រាប់ការសមពហុនិទស្សន្តត្រូវបានដកចេញពីការវិភាគ។ការកាត់ដែលប្រើគឺ <104 photons សម្រាប់ក្បូន និងចំនុច និង 103 សម្រាប់ដំណក់។ដំណក់ទឹកមានកម្រិតទាបជាង ព្រោះវាពិបាកក្នុងការទទួលបានខ្សែកោងបំបែកជាមួយនឹងតម្លៃអាំងតង់ស៊ីតេខ្ពស់ ដោយសារដំណក់ទឹកនៅក្នុងវាលរូបភាពជាធម្មតាតូចជាង និងមានចំនួនតិច។ROIs ដែលមានចំនួន photon លើសពីដែនកំណត់នៃការប្រមូលផ្តុំ photon (កំណត់ទៅ>500 counts/pixel) ក៏ត្រូវបានលុបចោលសម្រាប់ការវិភាគផងដែរ។ផ្គូផ្គងខ្សែកោងការបំបែកអាំងតង់ស៊ីតេដែលទទួលបានពីតំបន់ចំណាប់អារម្មណ៍ជាមួយនឹងអាំងតង់ស៊ីតេនៅ 90% នៃអតិបរមា (បន្តិចបន្ទាប់ពីអាំងតង់ស៊ីតេអតិបរមានៃការពុកផុយ) ពីការចាប់ផ្តើមនៃជីវិតសេវាកម្ម ដើម្បីធានាបាននូវការជ្រៀតជ្រែក IRF តិចតួចខណៈពេលដែលរក្សាបានដូចគ្នាសម្រាប់ការបំផ្លាញអាំងតង់ស៊ីតេទាំងអស់។ ការកំណត់ បង្អួចពេលវេលាដែលទាក់ទងត្រូវបានវិភាគពី 25 ទៅ 50 ROI សម្រាប់ក្បូន និងកន្លែង និង 15-25 ROI សម្រាប់ការធ្លាក់ចុះ រូបភាពដែលបានជ្រើសរើសពីរូបភាពចម្លងច្រើនជាង 4 ដែលបានកត់ត្រាពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ 3 ។ការធ្វើតេស្ត t-tailed ពីរត្រូវបានប្រើដើម្បីវាយតម្លៃភាពខុសគ្នានៃស្ថិតិរវាងប្រភេទសត្វ ឬរវាងប្រព័ន្ធ coacervate ។សម្រាប់ការវិភាគភីកសែលដោយភីកសែលនៃអាយុកាល (τ) ការបន្ថយអាយុកាលសរុបលើវាលសម្រាប់ឆានែលនីមួយៗត្រូវបានគណនា ហើយការប៉ាន់ស្មាននៃគំរូកាត់បន្ថយអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលសមាសភាគ 2/3 ត្រូវបានអនុវត្ត។បន្ទាប់មកការបន្ថយកម្រិតពេញមួយជីវិតសម្រាប់ភីកសែលនីមួយៗត្រូវបានបំពាក់ដោយប្រើតម្លៃ τ ដែលបានគណនាពីមុន ដែលបណ្តាលឱ្យមានរូបភាពសម pseudocolor FLIM ។ជួរអាយុកាលដែលសមនឹងកន្ទុយគឺដូចគ្នានៅគ្រប់រូបភាពទាំងអស់នៃប៉ុស្តិ៍ដូចគ្នា ហើយការពុកផុយនីមួយៗបង្កើតបាននូវហ្វូតុនគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីផ្តល់នូវភាពសមស្របដែលអាចទុកចិត្តបាន។សម្រាប់ការវិភាគ FRET ភីកសែលត្រូវបានជ្រើសរើសដោយអនុវត្តកម្រិតអាំងតង់ស៊ីតេទាបនៃ 100 ហ្វូតុន ដែលជាមធ្យមសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយ (FBG) នៃ 11 ហ្វូតុន។អាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៃឆានែលនីមួយៗត្រូវបានកែតម្រូវដោយកត្តាកែតម្រូវដែលបានកំណត់ដោយពិសោធន៍: 69 spectral crosstalk αគឺ 0.004, ការរំភើបចិត្តដោយផ្ទាល់βគឺ 0.0305, ប្រសិទ្ធភាពនៃការរកឃើញ γ គឺ 0.517 ។បន្ទាប់មកប្រសិទ្ធភាព FRET នៅកម្រិតភីកសែលត្រូវបានគណនាដោយប្រើសមីការខាងក្រោម៖
ដែលជាកន្លែងដែល FDD គឺជាអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ដែលបានសង្កេតនៅក្នុងឆានែលម្ចាស់ជំនួយ (ពណ៌បៃតង) FDA គឺជាអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ដែលត្រូវបានសង្កេតឃើញនៅក្នុងឆានែលទទួល (ក្រហម) ក្រោមការរំភើបចិត្តដោយប្រយោល ហើយ FAA គឺជាអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ដែលបានសង្កេតនៅក្នុងឆានែលអ្នកទទួល (ក្រហម) ក្រោមការរំភើបដោយផ្ទាល់ ( ភី) ។ជីពចរអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងឆានែល) ។
ដាក់ ​​100 µl នៃដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម LLPS ដែលមាន 25 µM monomeric ដែលគ្មានស្លាកសញ្ញា Tau441 (ដោយមានឬគ្មាន 25 µM αS) នៅក្នុង LLPS buffer (បន្ថែមដូចខាងលើ) នៅលើមីក្រូផ្លាត 96 អណ្តូងដែលមិនចងជាមួយថ្នាំកូត foil adhesive និងការបង្កើតដំណក់ទឹកត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយមីក្រូហ្វូន។ លំនឹង។ក្នុងរយៈពេល 10 នាទី។បន្ទាប់ពី 48 ម៉ោងនៃការ incubation នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់, វត្តមាននៃក្បូនប្រូតេអ៊ីននិងចំណុចត្រូវបានបញ្ជាក់។បន្ទាប់មកយករាវចេញដោយប្រុងប្រយ័ត្នពីលើក្បូនពីអណ្តូង បន្ទាប់មកបន្ថែម 50 L នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន dissociation (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) និង incubate សម្រាប់ 10 នាទី។កំហាប់អំបិលខ្ពស់ធានាថា LLPS នឹងមិនកើតឡើងវិញទេដោយសារសំណល់ PEG ហើយការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនដែលអាចបង្កើតបានតែដោយអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាតនឹងត្រូវរុះរើ។បន្ទាប់មកផ្នែកខាងក្រោមនៃអណ្តូងត្រូវបានខ្ចាត់ខ្ចាយដោយប្រុងប្រយ័ត្នជាមួយនឹងព័ត៌មានជំនួយ micropipette ហើយដំណោះស្រាយលទ្ធផលត្រូវបានផ្ទេរទៅអណ្តូងសង្កេតទទេ។បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់សំណាកដោយ 50 μM ThT រយៈពេល 1 ម៉ោង វត្តមាននៃចំណុចដាច់ស្រយាលត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍ WF ។រៀបចំ sonicated αS fibrils ដោយ incubating 300 µl នៃ 70-µM αS ដំណោះស្រាយនៅក្នុង PBS ជាមួយ pH 7.4, sodium azide 0.01% នៅ 37 ° C និង 200 rpm នៅលើ shaker គន្លងរយៈពេល 7 ថ្ងៃ។បន្ទាប់មកដំណោះស្រាយត្រូវបាន centrifuged នៅ 9600 ×g សម្រាប់ 30 នាទី គ្រាប់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញនៅក្នុង PBS pH 7.4 និង sonicated (1 នាទី, 50% វដ្ត, 80% amplitude នៅក្នុង Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibril samples ជាមួយនឹងការបែងចែកទំហំស្មើគ្នានៃសរសៃតូចៗ។
ការវិភាគ FCS/FCCS និងការរកឃើញចៃដន្យពីរពណ៌ (TCCD) ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើមីក្រូទស្សន៍ fluorescent confocal ដែលបានដោះស្រាយពេលវេលា MT200 ដូចគ្នា (Pico-Quant, Berlin, Germany) ដែលប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍មីក្រូទស្សន៍ FLIM-FRET ដោយប្រើរបៀប PIE ។ថាមពលឡាស៊ែរសម្រាប់ការពិសោធន៍ទាំងនេះត្រូវបានបន្ថែមទៅ 6.0 µW (481 nm) និង 6.2 µW (637 nm) ។ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃថាមពលឡាស៊ែរទាំងនេះត្រូវបានជ្រើសរើសដើម្បីបង្កើតពន្លឺស្រដៀងគ្នាសម្រាប់គូនៃ fluorophores ដែលបានប្រើខណៈពេលដែលសម្រេចបាននូវអត្រាការរាប់ដ៏ល្អប្រសើរ និងជៀសវាងការឆ្លុះពន្លឺ និងការតិត្ថិភាព។ទាំងការប្រមូលទិន្នន័យ និងការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី SymphoTime64 កំណែ 2.3 ដែលមានពាណិជ្ជកម្ម (PicoQuant, Berlin, Germany)។
គំរូនៃការប្រមូលផ្តុំ αS/Tau ដាច់ស្រយាលដែលទទួលបានដោយប្រើ LLPS ត្រូវបានពនឺនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្នឯកោទៅជាកំហាប់ម៉ូលេគុលដែលសមស្រប (ជាធម្មតាការរំលាយ 1:500 ចាប់តាំងពីការប្រមូលផ្តុំគឺមានកំហាប់ទាបរួចទៅហើយនៅពេលដែលដាច់ឆ្ងាយពីសំណាក coacervate)។គំរូត្រូវបានអនុវត្តដោយផ្ទាល់ទៅគម្រប (Corning, សហរដ្ឋអាមេរិក) ដែលស្រោបដោយដំណោះស្រាយ BSA នៅកំហាប់ 1 mg/mL ។
សម្រាប់ការវិភាគ PIE-smFRET នៅក្នុងបណ្តាញពណ៌បៃតង និងក្រហម កម្រិតអាំងតង់ស៊ីតេទាបនៃ 25 ហ្វូតុង ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីច្រោះចេញនូវសញ្ញាដែលមានអាំងតង់ស៊ីតេទាបដែលបណ្តាលមកពីព្រឹត្តិការណ៍ monomeric (ចំណាំថា monomers លើសពីចំនួនគំរូសរុបបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការប្រមូលផ្តុំដាច់ដោយឡែក) ។កម្រិតនេះត្រូវបានគណនាជាប្រាំដងនៃអាំងតង់ស៊ីតេមធ្យមនៃ αS monomeric ដែលទទួលបានពីការវិភាគនៃសំណាក monomer សុទ្ធ ដើម្បីជ្រើសរើសជាពិសេសសម្រាប់សរុបសម្រាប់ការវិភាគ។សៀគ្វីដ្រាយ PIE រួមជាមួយនឹងការទទួលបានទិន្នន័យ TSCPC បានបើកដំណើរការកម្មវិធីតម្រងទម្ងន់ពេញមួយជីវិត ដែលជួយលុបបំបាត់ផ្ទៃខាងក្រោយ និងវិសាលគម crosstalk ។អាំងតង់ស៊ីតេនៃអណ្តាតភ្លើងដែលបានជ្រើសរើសដោយប្រើកម្រិតខាងលើត្រូវបានកែដំរូវដោយប្រើសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយជាមធ្យមដែលបានកំណត់ពីអ៊ីស្តូក្រាមនៃការកើតឡើងធៀបនឹងអាំងតង់ស៊ីតេ/ធុងនៃសំណាកសតិបណ្ដោះអាសន្នប៉ុណ្ណោះ។ការផ្ទុះដែលជាប់ទាក់ទងនឹងការប្រមូលផ្តុំធំជាធម្មតាកាន់កាប់ធុងសំរាមជាប់ៗគ្នាជាច្រើននៅក្នុងពេលវេលាដាន (កំណត់ទៅ 1 ms) ។នៅក្នុងករណីទាំងនេះ ធុងដែលមានកម្លាំងអតិបរមាត្រូវបានជ្រើសរើស។សម្រាប់ការវិភាគ FRET និង stoichiometric កត្តាហ្គាម៉ាដែលបានកំណត់តាមទ្រឹស្តី γ (0.517) ត្រូវបានប្រើ។Spectral crosstalk និងការរួមចំណែកដោយផ្ទាល់នៃការរំភើបគឺមានការធ្វេសប្រហែស (កំណត់ដោយពិសោធន៍) នៅថាមពលឡាស៊ែររំភើបដែលបានប្រើ។ប្រសិទ្ធភាពនិង stoichiometry នៃ FRET នៅក្នុងការផ្ទុះមួយត្រូវបានគណនាដូចខាងក្រោម។