សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
គ្រាប់រំកិលបង្ហាញអត្ថបទបីក្នុងមួយស្លាយ។ប្រើប៊ូតុងខាងក្រោយ និងបន្ទាប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយ ឬប៊ូតុងឧបករណ៍បញ្ជាស្លាយនៅចុងបញ្ចប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយនីមួយៗ។

317 អ្នកផ្គត់ផ្គង់បំពង់ដែកអ៊ីណុក

តារាងសមាសធាតុគីមីនៃសម្ភារៈដែកអ៊ីណុក

SPACA6 គឺជាប្រូតេអ៊ីនលើផ្ទៃដែលបង្ហាញមេជីវិតឈ្មោល ដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការលាយបញ្ចូលគ្នារវាង gamete ក្នុងអំឡុងពេលបន្តពូជផ្លូវភេទរបស់ថនិកសត្វ។ទោះបីជាតួនាទីជាមូលដ្ឋាននេះក៏ដោយ ក៏មុខងារជាក់លាក់របស់ SPACA6 ត្រូវបានគេយល់មិនសូវច្បាស់។យើងបំភ្លឺរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃដែន extracellular នៃ SPACA6 នៅដំណោះស្រាយ 2.2 Å ដោយបង្ហាញប្រូតេអ៊ីនដែនពីរដែលផ្សំឡើងដោយបាច់ខ្សែបួន និង Ig-like β-sandwiches ដែលភ្ជាប់ដោយតំណភ្ជាប់ដែលអាចបត់បែនបាន។រចនាសម្ព័ននេះប្រហាក់ប្រហែលនឹង IZUMO1 ដែលជាប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ gamete មួយផ្សេងទៀតដែលធ្វើឱ្យសមាជិកស្ថាបនិក SPACA6 និង IZUMO1 នៃគ្រួសារកំពូលនៃប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការបង្កកំណើត សំដៅនៅទីនេះថាជាគ្រួសារ IST ។IST superfamily ត្រូវបានកំណត់ដោយរចនាសម្ព័ន្ធដោយបាច់បួន-helix twisted របស់វា និងគូនៃគំនូរ CXXC ភ្ជាប់ disulfide-linked ។ការស្វែងរក AlphaFold ដែលមានមូលដ្ឋានលើរចនាសម្ព័ន្ធនៃ proteome មនុស្សបានកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនបន្ថែមនៃគ្រួសារ superfamily នេះ។គួរកត់សម្គាល់ថាប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះជាច្រើនត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការលាយ gamete ។រចនាសម្ព័ន SPACA6 និងទំនាក់ទំនងរបស់វាជាមួយសមាជិកដទៃទៀតនៃគ្រួសារ IST ផ្តល់នូវតំណភ្ជាប់ដែលបាត់នៅក្នុងចំណេះដឹងរបស់យើងអំពីការបញ្ចូលគ្នានៃថនិកសត្វ gamete ។
ជីវិតមនុស្សគ្រប់រូបចាប់ផ្តើមដោយ gametes haploid ពីរដាច់ដោយឡែកពីគ្នា៖ មេជីវិតឈ្មោលរបស់ឪពុក និងស៊ុតរបស់ម្តាយ។មេជីវិតឈ្មោលនេះគឺជាអ្នកឈ្នះនៃដំណើរការជ្រើសរើសដ៏ខ្លាំងក្លាក្នុងអំឡុងពេលដែលកោសិកាមេជីវិតឈ្មោលរាប់លានឆ្លងកាត់ប្រដាប់បន្តពូជស្ត្រី ជំនះឧបសគ្គផ្សេងៗ 1 និងឆ្លងកាត់សមត្ថភាពដែលបង្កើនចលនារបស់ពួកគេ និងដំណើរការនៃសមាសធាតុផ្ទៃ 2,3,4 ។ទោះបីជាមេជីវិតឈ្មោល និងអូកស៊ីតរកឃើញគ្នាទៅវិញទៅមកក៏ដោយ ក៏ដំណើរការមិនទាន់ចប់នៅឡើយទេ។oocyte ត្រូវបានហ៊ុំព័ទ្ធដោយស្រទាប់នៃកោសិកា cumulus និងរបាំង glycoprotein ដែលហៅថា zona pellucida ដែលតាមរយៈនោះមេជីវិតឈ្មោលត្រូវតែឆ្លងកាត់ដើម្បីចូលទៅក្នុង oocyte ។Spermatozoa ប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃម៉ូលេគុលនៃការស្អិតលើផ្ទៃ និងអង់ស៊ីមដែលជាប់ទាក់ទងនឹងភ្នាស និងសម្ងាត់ ដើម្បីយកឈ្នះឧបសគ្គចុងក្រោយទាំងនេះ 5.ម៉ូលេគុល និងអង់ស៊ីមទាំងនេះត្រូវបានរក្សាទុកជាចម្បងនៅក្នុងភ្នាសខាងក្នុង និងម៉ាទ្រីស acrosomal ហើយត្រូវបានរកឃើញនៅពេលដែលភ្នាសខាងក្រៅនៃមេជីវិតឈ្មោលត្រូវបាន lysed ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម acrosomal6 ។ជំហានចុងក្រោយក្នុងដំណើរដ៏ខ្លាំងក្លានេះគឺព្រឹត្តិការណ៍នៃការបញ្ចូលគ្នារវាងមេជីវិតឈ្មោល និងស៊ុត ដែលក្នុងនោះកោសិកាទាំងពីរបញ្ចូលគ្នានូវភ្នាសរបស់ពួកគេឱ្យក្លាយទៅជាសារពាង្គកាយតែមួយ diploid7 ។ថ្វីបើដំណើរការនេះមានភាពលេចធ្លោក្នុងការបន្តពូជរបស់មនុស្សក៏ដោយ អន្តរកម្មម៉ូលេគុលចាំបាច់ត្រូវបានយល់យ៉ាងលំបាក។
បន្ថែមពីលើការបង្កកំណើតរបស់ gametes គីមីសាស្ត្រនៃការលាយបញ្ចូលគ្នានៃស្រទាប់ខ្លាញ់ពីរត្រូវបានសិក្សាយ៉ាងទូលំទូលាយ។ជាទូទៅ ការលាយភ្នាសគឺជាដំណើរការមិនអំណោយផលដ៏ខ្លាំងក្លាដែលតម្រូវឱ្យមានកាតាលីករប្រូតេអ៊ីនដើម្បីឆ្លងកាត់ការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធដែលនាំភ្នាសពីរមកជិតគ្នា ដោយបំបែកភាពជាប់គ្នារបស់វា និងបណ្តាលឱ្យមានការលាយបញ្ចូលគ្នា 8,9 ។កាតាលីករប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះត្រូវបានគេស្គាល់ថាជា fuogens ហើយត្រូវបានគេរកឃើញនៅក្នុងប្រព័ន្ធ fusion រាប់មិនអស់។ពួកវាត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបញ្ចូលមេរោគទៅក្នុងកោសិកាម៉ាស៊ីន (ឧទាហរណ៍ gp160 ក្នុងមេរោគអេដស៍-1 ការកើនឡើងនៃមេរោគឆ្លងមេរោគ hemagglutinin ក្នុងមេរោគគ្រុនផ្តាសាយ) 10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 និង gamete-forming fusions នៅក្នុង eukaryotes ទាប ( HAP2/GCS1 នៅក្នុងរុក្ខជាតិ ប្រូទីស និង arthropods) 16,17,18,19។Fusogens សម្រាប់ gametes របស់មនុស្សមិនទាន់ត្រូវបានរកឃើញនៅឡើយទេ ទោះបីជាប្រូតេអ៊ីនជាច្រើនត្រូវបានបង្ហាញថាមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការភ្ជាប់ gamete និងការបញ្ចូលគ្នាក៏ដោយ។CD9 ដែលបង្ហាញដោយ oocyte ដែលជាប្រូតេអ៊ីន transmembrane ដែលត្រូវការសម្រាប់ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃកណ្តុរ និង gametes របស់មនុស្ស គឺជាមនុស្សដំបូងគេដែលត្រូវបានរកឃើញនៅថ្ងៃទី 21,22,23។ទោះបីជាមុខងារច្បាស់លាស់របស់វានៅតែមិនច្បាស់លាស់ តួនាទីក្នុងការ adhesion រចនាសម្ព័ន្ធនៃការ adhesion foci នៅលើ microvilli ស៊ុត និង/ឬការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មត្រឹមត្រូវនៃប្រូតេអ៊ីនផ្ទៃ oocyte ហាក់ដូចជា 24,25,26។ប្រូតេអ៊ីនធម្មតាបំផុតពីរដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការលាយ gamete គឺប្រូតេអ៊ីនមេជីវិតឈ្មោល IZUMO127 និងប្រូតេអ៊ីន oocyte JUNO28 ហើយការផ្សារភ្ជាប់គ្នាទៅវិញទៅមករបស់ពួកគេគឺជាជំហានដ៏សំខាន់មួយក្នុងការទទួលស្គាល់ gamete និងការស្អិតមុនពេលការបញ្ចូលគ្នា។កណ្ដុរ Izumo1 ឈ្មោល និងកណ្ដុរ Juno ញីគឺគ្មានមេរោគទាំងស្រុងទេ នៅក្នុងគំរូទាំងនេះ មេជីវិតឈ្មោលចូលទៅក្នុងលំហ perivitelline ប៉ុន្តែ gametes មិនបញ្ចូលគ្នាទេ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការប្រសព្វត្រូវបានកាត់បន្ថយនៅពេលដែល gametes ត្រូវបានព្យាបាលដោយអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង IZUMO1 ឬ JUNO27,29 នៅក្នុងការពិសោធន៍នៃការបង្កកំណើតរបស់មនុស្សនៅក្នុង vitro ។
ថ្មីៗនេះ ក្រុមដែលទើបរកឃើញថ្មីនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបង្ហាញពីមេជីវិតឈ្មោលដែលមានលក្ខណៈស្រដៀងទៅនឹង IZUMO1 និង JUNO20,30,31,32,33,34,35 ត្រូវបានរកឃើញ។ប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ភ្នាសមេជីវិតឈ្មោល 6 (SPACA6) ត្រូវបានគេកំណត់ថាមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបង្កកំណើតនៅក្នុងការសិក្សា murine mutagenesis ទ្រង់ទ្រាយធំ។ការបញ្ចូល transgene ទៅក្នុងហ្សែន Spaca6 ផលិតមេជីវិតឈ្មោលដែលមិនអាចបំប្លែងបាន ទោះបីជាមេជីវិតឈ្មោលទាំងនេះជ្រៀតចូលទៅក្នុងលំហ perivitelline 36 ក៏ដោយ។ការ​សិក្សា​ធ្លាក់​ជា​បន្តបន្ទាប់​លើ​សត្វ​កណ្តុរ​បាន​បញ្ជាក់​ថា Spaca6 ត្រូវ​បាន​ទាមទារ​សម្រាប់ gamete fusion 30,32 ។SPACA6 ត្រូវបានសម្តែងស្ទើរតែទាំងស្រុងនៅក្នុងពងស្វាស និងមានលំនាំធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មស្រដៀងទៅនឹង IZUMO1 ពោលគឺនៅក្នុងភាពស្និទ្ធស្នាលនៃមេជីវិតឈ្មោល មុនពេលប្រតិកម្ម acrosomal ហើយបន្ទាប់មកធ្វើចំណាកស្រុកទៅកាន់តំបន់អេក្វាទ័របន្ទាប់ពីប្រតិកម្ម acrosomal 30,32 ។Spaca6 homologues មាននៅក្នុងពពួកថនិកសត្វជាច្រើនប្រភេទ និង eukaryotes 30 ផ្សេងទៀត ហើយសារៈសំខាន់របស់វាសម្រាប់ការលាយ gamete របស់មនុស្សត្រូវបានបង្ហាញដោយការទប់ស្កាត់ការបង្កកំណើតរបស់មនុស្សនៅក្នុង vitro ដោយភាពធន់នឹង SPACA6 30 ។មិនដូច IZUMO1 និង JUNO ព័ត៌មានលម្អិតនៃរចនាសម្ព័ន្ធ អន្តរកម្ម និងមុខងាររបស់ SPACA6 នៅតែមិនច្បាស់លាស់។
ដើម្បីយល់កាន់តែច្បាស់អំពីដំណើរការជាមូលដ្ឋានដែលស្ថិតនៅក្រោមការលាយបញ្ចូលគ្នានៃមេជីវិតឈ្មោល និងស៊ុតរបស់មនុស្ស ដែលនឹងអនុញ្ញាតឱ្យយើងជូនដំណឹងអំពីការអភិវឌ្ឍន៍នាពេលអនាគតក្នុងការរៀបចំផែនការគ្រួសារ និងការព្យាបាលការមានកូន យើងបានធ្វើការសិក្សាលើរចនាសម្ព័ន្ធ និងជីវគីមី SPACA6 ។រចនាសម្ព័នគ្រីស្តាល់នៃដែន extracellular នៃ SPACA6 បង្ហាញពីបណ្តុំបួន helical (4HB) និងដែន immunoglobulin-like (Ig-like) ដែលតភ្ជាប់ដោយតំបន់ដែលអាចបត់បែនបាន។ដូចដែលបានព្យាករណ៍នៅក្នុងការសិក្សាពីមុន 7,32,37 រចនាសម្ព័ន្ធដែននៃ SPACA6 គឺស្រដៀងទៅនឹងមនុស្ស IZUMO1 ហើយប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរចែករំលែកគំនូរមិនធម្មតាមួយ: 4HB ជាមួយនឹងផ្ទៃ helical រាងត្រីកោណ និងគំនូរ CXXC ភ្ជាប់ disulfide មួយគូ។យើងស្នើថាឥឡូវនេះ IZUMO1 និង SPACA6 កំណត់ប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារដែលទាក់ទងនឹងរចនាសម្ព័ន្ធធំជាងដែលទាក់ទងនឹងការបញ្ចូលគ្នានៃ gamete ។ដោយប្រើលក្ខណៈពិសេសតែមួយគត់សម្រាប់គ្រួសារ superfamily យើងបានធ្វើការស្វែងរកយ៉ាងពេញលេញសម្រាប់ proteome មនុស្សរចនាសម្ព័ន្ធ AlphaFold ដោយកំណត់អត្តសញ្ញាណសមាជិកបន្ថែមនៃគ្រួសារ superfamily នេះ រួមទាំងសមាជិកជាច្រើនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការលាយ gamete និង/ឬការបង្កកំណើត។ឥឡូវនេះ វាហាក់ដូចជាមានផ្នត់រចនាសម្ព័ន្ធទូទៅ និងជាក្រុមនៃប្រូតេអ៊ីនដែលជាប់ទាក់ទងនឹងការបញ្ចូលគ្នានៃ gamete ហើយរចនាសម្ព័ន្ធរបស់យើងផ្តល់នូវផែនទីម៉ូលេគុលនៃទិដ្ឋភាពសំខាន់នៃយន្តការ fusion gamete របស់មនុស្ស។
SPACA6 គឺជាប្រូតេអ៊ីនឆ្លងកាត់តែមួយដែលមាន glycan ភ្ជាប់ N មួយនិងចំណង disulfide ប្រាំមួយ putative (រូបភាព S1a និង S2) ។យើងបានបង្ហាញពីដែន extracellular របស់មនុស្ស SPACA6 (សំណល់ 27–246) នៅក្នុងកោសិកា Drosophila S2 និងបានបន្សុតប្រូតេអ៊ីនដោយប្រើនីកែល affinity ការផ្លាស់ប្តូរ cation និង chromatography ដែលមិនរាប់បញ្ចូលទំហំ (រូបភាព S1b) ។SPACA6 ectodomain ដែលបន្សុតមានស្ថេរភាព និងដូចគ្នាបេះបិទ។ការវិភាគដោយប្រើ chromatography ដែលមិនរាប់បញ្ចូលទំហំរួមផ្សំជាមួយនឹងការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺពហុកោណ (SEC-MALS) បានបង្ហាញពីកំពូលមួយជាមួយនឹងទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលបានគណនានៃ 26.2 ± 0.5 kDa (រូបភាព S1c) ។នេះគឺស្របជាមួយនឹងទំហំនៃ SPACA6 monomeric ectodomain ដែលបង្ហាញថា oligomerization មិនបានកើតឡើងកំឡុងពេលបន្សុតទេ។លើសពីនេះ វិសាលគមឌីគ្រីសស្កុបរាងជារង្វង់ (ស៊ីឌី) បានបង្ហាញរចនាសម្ព័ន្ធ α/β ចម្រុះដែលមានចំណុចរលាយ 51.3 °C (រូបភាព S1d, e)។Deconvolution នៃ CD spectra បានបង្ហាញ 38.6% α-helical និង 15.8% β-stranded element (រូបភាព S1d) ។
SPACA6 ectodomain ត្រូវបានគ្រីស្តាល់ដោយប្រើម៉ាទ្រីសចៃដន្យ seeding38 ជាលទ្ធផលនៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យដែលមានដំណោះស្រាយ 2.2 Å (តារាងទី 1 និងរូបភាព S3) ។ដោយប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃការជំនួសម៉ូលេគុលដែលមានមូលដ្ឋានលើបំណែក និងទិន្នន័យដំណាក់កាល SAD ជាមួយនឹងការប៉ះពាល់ bromide សម្រាប់ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ (តារាងទី 1 និងរូបភាព S4) គំរូចម្រាញ់ចុងក្រោយមានសំណល់ 27-246 ។នៅពេលកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ នោះមិនមានរចនាសម្ព័ន្ធពិសោធន៍ ឬ AlphaFold ទេ។SPACA6 ectodomain វាស់ 20 Å × 20 Å × 85 Å មានប្រាំពីរ helices និងប្រាំបួន β-strands និងមានផ្នត់ទីបី elongated ស្ថេរភាពដោយចំណង disulfide ប្រាំមួយ (រូបភាព 1a, ខ) ។ដង់ស៊ីតេអេឡិចត្រុងខ្សោយនៅចុងបញ្ចប់នៃសង្វាក់ចំហៀង Asn243 បង្ហាញថាសំណល់នេះគឺជា glycosylation N-linked ។រចនាសម្ព័នមានដែនពីរ៖ បណ្តុំ N-terminal four-helix bundle (4HB) និង C-terminal Ig-like domain ជាមួយនឹងតំបន់ hinge កម្រិតមធ្យមរវាងពួកវា (រូបភាព 1c)។
រចនាសម្ព័ន្ធនៃដែន extracellular នៃ SPACA6.ដ្យាក្រាមខ្សែនៃដែនក្រៅកោសិកានៃ SPACA6 ពណ៌នៃខ្សែសង្វាក់ពី N ដល់ C-terminus ពីពណ៌ខៀវងងឹតទៅក្រហមងងឹត។ស៊ីស្ទីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងចំណង disulfide ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ស្វាយ។b Topology នៃដែន extracellular នៃ SPACA6.ប្រើពណ៌ចម្រុះដូចក្នុងរូបភាពទី 1 ក។c SPACA6 ដែនក្រៅកោសិកា។តារាង 4HB, hinge, និង Ig-like domain charts មានពណ៌ទឹកក្រូច បៃតង និងខៀវ រៀងគ្នា។ស្រទាប់មិនត្រូវបានគូរដើម្បីធ្វើមាត្រដ្ឋានទេ។
ដែន 4HB នៃ SPACA6 រួមមាន helices សំខាន់ៗចំនួនបួន (helices 1–4) ដែលត្រូវបានរៀបចំក្នុងទម្រង់ជា helix helix (រូបភាព 2a) ឆ្លាស់គ្នារវាង antiparallel និង parallel interactions (Fig ។ 2b) ។helix វេនតែមួយបន្ថែមតូចមួយ (helix 1′) ត្រូវបានដាក់កាត់កែងទៅនឹងបណ្តុំ បង្កើតជាត្រីកោណជាមួយ helices 1 និង 2 ។ ត្រីកោណនេះត្រូវបានខូចទ្រង់ទ្រាយបន្តិចនៅក្នុងការវេចខ្ចប់ helical-twisted នៃការវេចខ្ចប់ក្រាស់ដែលទាក់ទងនៃ helices 3 និង 4 ( រូប ២ ក)។
គំនូសតាងបន្ទះស្ថានីយ 4HB N ។b ទិដ្ឋភាពកំពូលនៃបណ្តុំនៃ helices បួន ដែល helix នីមួយៗត្រូវបានបន្លិចពណ៌ខៀវងងឹតនៅ N-terminus និងពណ៌ក្រហមងងឹតនៅ C-terminus ។c ដ្យាក្រាមរង្វង់មូលពីលើចុះក្រោមសម្រាប់ 4HB ជាមួយនឹងសំណល់នីមួយៗបង្ហាញជារង្វង់ដែលមានស្លាកលេខកូដអាស៊ីតអាមីណូដែលមានអក្សរតែមួយ។មានតែអាស៊ីដអាមីណូទាំងបួននៅផ្នែកខាងលើនៃកង់ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានដាក់លេខ។សំណល់មិនរាងប៉ូលមានពណ៌លឿង សំណល់ប៉ូលដែលមិនមានបន្ទុកមានពណ៌បៃតង សំណល់ដែលគិតជាវិជ្ជមានមានពណ៌ខៀវ ហើយសំណល់ដែលគិតជាអវិជ្ជមានមានពណ៌ក្រហម។d មុខត្រីកោណនៃដែន 4HB ដែលមាន 4HBs ជាពណ៌ទឹកក្រូច និងហ៊ីងជាពណ៌បៃតង។ធាតុទាំងពីរបង្ហាញពីចំណង disulfide រាងជាដំបង។
4HB ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំនៅលើស្នូល hydrophobic ខាងក្នុងដែលមានសមាសភាពជាចម្បងនៃសំណល់ aliphatic និង aromatic (រូបភាព 2c) ។ស្នូលមានចំណង disulfide រវាង Cys41 និង Cys55 ដែលភ្ជាប់ helices 1 និង 2 ជាមួយគ្នានៅក្នុងត្រីកោណដែលលើកឡើងខាងលើ (រូបភាព 2d) ។ចំណង disulfide បន្ថែមពីរត្រូវបានបង្កើតឡើងរវាងគំនូរ CXXC នៅក្នុង Helix 1′ និងគំនូរ CXXC មួយផ្សេងទៀតដែលបានរកឃើញនៅចុងនៃ β-hairpin នៅក្នុងតំបន់ hinge (រូបភាព 2d) ។សំណល់ arginine អភិរក្សដែលមានមុខងារមិនស្គាល់ (Arg37) មានទីតាំងនៅខាងក្នុងត្រីកោណប្រហោងដែលបង្កើតឡើងដោយ helices 1′, 1 និង 2. អាតូមកាបូន Aliphatic Cβ, Cγ និង Cδ Arg37 ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយស្នូល hydrophobic ហើយក្រុម guanidine របស់វាធ្វើចលនារង្វិល រវាង helices 1′ និង 1 តាមរយៈអន្តរកម្មរវាងឆ្អឹងខ្នង Thr32 និងខ្សែសង្វាក់ចំហៀង (រូបភាព S5a, ខ) ។Tyr34 លាតសន្ធឹងចូលទៅក្នុងបែហោងធ្មែញបន្សល់ទុកបែហោងធ្មែញតូចៗចំនួនពីរដែលតាមរយៈនោះ Arg37 អាចធ្វើអន្តរកម្មជាមួយសារធាតុរំលាយ។
Ig-like β-sandwich domains គឺជាពពួកពពួកប្រូតេអ៊ីនដ៏ធំដែលចែករំលែកលក្ខណៈទូទៅនៃសន្លឹក amphipathic β-sheets ពហុខ្សែពីរ ឬច្រើនដែលធ្វើអន្តរកម្មតាមរយៈស្នូល hydrophobic 39។ C-terminal Ig-like domain នៃ SPACA6 មានលំនាំដូចគ្នា និងមានពីរស្រទាប់ (រូបភាព S6a)។សន្លឹកទី 1 គឺជាសន្លឹកបេតានៃខ្សែបួន (ខ្សែ D, F, H, និង I) ដែលខ្សែ F, H និងខ្ញុំបង្កើតជាការរៀបចំប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាឡែល ហើយខ្សែ I និង D ធ្វើអន្តរកម្មស្របគ្នា។តារាងទី 2 គឺជាសន្លឹកបេតាដែលមានខ្សែពីរប្រឆាំងប៉ារ៉ាឡែលតូចមួយ (ខ្សែ E និង G) ។ចំណង disulfide ខាងក្នុងត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅចន្លោះ C-terminus នៃខ្សែសង្វាក់ E និងកណ្តាលនៃខ្សែសង្វាក់ H (Cys170-Cys226) (រូបភាព S6b) ។ចំណង disulfide នេះគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងចំណង disulfide នៅក្នុងដែន β-sandwich នៃ immunoglobulin 40,41 ។
សន្លឹក β-strand ចំនួនបួនបត់តាមបណ្តោយប្រវែងទាំងមូលរបស់វា បង្កើតជាគែម asymmetrical ដែលខុសគ្នានៅក្នុងរូបរាង និង electrostatics ។គែមស្តើងជាងគឺជាផ្ទៃបរិស្ថានអ៊ីដ្រូហ្វូប៊ីកសំប៉ែតដែលលេចធ្លោបើប្រៀបធៀបទៅនឹងផ្ទៃមិនស្មើគ្នា និងចម្រុះដែលនៅសេសសល់នៅក្នុង SPACA6 (រូបភាព S6b, គ)។ហាឡូនៃក្រុមកាបូនអ៊ីល/អាមីណូ ឆ្អឹងខ្នងដែលលាតត្រដាង និងខ្សែសង្វាក់ចំហៀងប៉ូលជុំវិញផ្ទៃទឹក (រូបភាព S6c) ។រឹមកាន់តែទូលំទូលាយត្រូវបានគ្របដណ្ដប់ដោយផ្នែក helical capped ដែលរារាំងផ្នែក N-terminal នៃស្នូល hydrophobic និងបង្កើតជាចំណងអ៊ីដ្រូសែនបីជាមួយនឹងក្រុមប៉ូលបើកចំហនៃឆ្អឹងខ្នងខ្សែ F (រូបភាព S6d) ។ផ្នែក C-terminal នៃគែមនេះបង្កើតជាហោប៉ៅធំមួយដែលមានស្នូល hydrophobic ដែលលាតត្រដាងដោយផ្នែក។ហោប៉ៅត្រូវបានហ៊ុំព័ទ្ធដោយបន្ទុកវិជ្ជមានដោយសារតែសំណុំបីនៃសំណល់ arginine ពីរដង (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 និង Arg212-Arg214) និងអ៊ីស្ទីឌីនកណ្តាល (His220) (រូបភាព S6e) ។
តំបន់ hinge គឺជាផ្នែកខ្លីមួយរវាងដែន helical និងដែនដូច Ig ដែលមានស្រទាប់ β-stranded បីប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាឡែលមួយ (strands A, B និង C) helix តូច 310 និងផ្នែក helical ចៃដន្យវែងជាច្រើន។(រូបភាព S7) ។បណ្តាញនៃទំនាក់ទំនង covalent និង electrostatic នៅក្នុងតំបន់ hinge ហាក់ដូចជាធ្វើឱ្យការតំរង់ទិសរវាង 4HB និង Ig-like domain មានស្ថេរភាព។បណ្តាញអាចបែងចែកជាបីផ្នែក។ផ្នែកទីមួយរួមមានគំនូរ CXXC ពីរ (27CXXC30 និង 139CXXC142) ដែលបង្កើតជាចំណង disulfide មួយគូរវាង β-hairpin នៅក្នុង hinge និង helix 1′ ក្នុង 4HB ។ផ្នែកទីពីររួមមានអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិចរវាងដែន Ig-like និង hinge ។Glu132 នៅក្នុង hinge បង្កើតជាស្ពានអំបិលជាមួយ Arg233 នៅក្នុងដែន Ig-like និង Arg135 នៅក្នុង hinge ។ផ្នែកទីបីរួមមានចំណង covalent រវាងដែន Ig-like និងតំបន់ hinge ។ចំណង disulfide ពីរ (Cys124-Cys147 និង Cys128-Cys153) ភ្ជាប់រង្វិលជុំ hinge ទៅ linker ដែលមានស្ថេរភាពដោយអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិចរវាង Gln131 និងក្រុមមុខងារឆ្អឹងខ្នង ដែលអនុញ្ញាតឱ្យចូលទៅកាន់ដែនដូច Ig ដំបូង។ខ្សែសង្វាក់។
រចនាសម្ព័ន្ធនៃ SPACA6 ectodomain និងរចនាសម្ព័ន្ធបុគ្គលនៃដែន 4HB និង Ig-like ត្រូវបានប្រើដើម្បីស្វែងរកកំណត់ត្រាស្រដៀងគ្នាតាមរចនាសម្ព័ន្ធនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីន 42 ។យើងបានកំណត់ការផ្គូផ្គងជាមួយនឹងពិន្ទុ Dali Z ខ្ពស់ គម្លាតស្តង់ដារតូច និងពិន្ទុ LALI ធំ (ក្រោយមកទៀតគឺជាចំនួនសំណល់សមមូលរចនាសម្ព័ន្ធ)។ខណៈពេលដែលការចុចដំបូងចំនួន 10 ពីការស្វែងរក ectodomain ពេញលេញ (តារាង S1) មានពិន្ទុ Z ដែលអាចទទួលយកបាននៃ>842 ការស្វែងរកសម្រាប់ 4HB ឬ Ig-like domain តែម្នាក់ឯងបានបង្ហាញថាការចុចទាំងនេះភាគច្រើនត្រូវគ្នាទៅនឹង β-sandwiches ប៉ុណ្ណោះ។ផ្នត់​ដែល​មាន​នៅ​ក្នុង​ប្រូតេអ៊ីន​ជា​ច្រើន។ការស្វែងរកទាំងបីនៅក្នុង Dali ទទួលបានលទ្ធផលតែមួយប៉ុណ្ណោះ៖ IZUMO1។
វាត្រូវបានណែនាំជាយូរមកហើយថា SPACA6 និង IZUMO1 ចែករំលែកភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធ 7,32,37 ។ទោះបីជា ectodomains នៃប្រូតេអ៊ីនដែលភ្ជាប់គ្នារវាង gamete ទាំងពីរនេះចែករំលែកអត្តសញ្ញាណលំដាប់លំដាប់តែ 21% ប៉ុណ្ណោះ (រូបភាព S8a) ភស្តុតាងស្មុគ្រស្មាញ រួមទាំងគំរូចំណង disulfide ដែលត្រូវបានអភិរក្ស និង C-terminal Ig-like domain ដែលបានព្យាករណ៍នៅក្នុង SPACA6 បានអនុញ្ញាតឱ្យមានការប៉ុនប៉ងដំបូងដើម្បីបង្កើត គំរូដូចគ្នានៃកណ្តុរ SPACA6 ដោយប្រើ IZUMO1 ជាគំរូ37។រចនាសម្ព័ន្ធរបស់យើងបញ្ជាក់ពីការព្យាករណ៍ទាំងនេះ និងបង្ហាញពីកម្រិតពិតនៃភាពស្រដៀងគ្នា។តាមពិត រចនាសម្ព័ន្ធ SPACA6 និង IZUMO137,43,44 ចែករំលែកស្ថាបត្យកម្មដែនពីរដូចគ្នា (រូបភាព S8b) ជាមួយនឹងដែន 4HB និង Ig-like β-sandwich ស្រដៀងគ្នាដែលតភ្ជាប់ដោយតំបន់ hinge (រូបភាព S8c) ។
IZUMO1 និង SPACA6 4HB មានភាពខុសគ្នាជាទូទៅពីបាច់វង់ធម្មតា។4HBs ធម្មតា ដូចអ្វីដែលបានរកឃើញនៅក្នុងស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន SNARE ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការបញ្ចូលគ្នានៃ endosomal 45,46 វាមានចន្លោះប្រហោងស្មើៗគ្នា ដែលរក្សាភាពកោងថេរជុំវិញអ័ក្សកណ្តាល 47។ ផ្ទុយទៅវិញ ដែន helical ទាំងនៅក្នុង IZUMO1 និង SPACA6 ត្រូវបានបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយ ជាមួយនឹងកោងអថេរ និង ការវេចខ្ចប់មិនស្មើគ្នា (រូបភាព S8d) ។ការបង្វិលប្រហែលជាបណ្តាលមកពីត្រីកោណដែលបង្កើតឡើងដោយ helices 1′, 1 និង 2 ត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុង IZUMO1 និង SPACA6 ហើយមានស្ថេរភាពដោយគំនូរ CXXC ដូចគ្នានៅលើ helix 1′ ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ចំណង disulfide បន្ថែមដែលរកឃើញនៅក្នុង SPACA6 (Cys41 និង Cys55 ដែលភ្ជាប់ជាមួយ helices 1 និង 2 ខាងលើ) បង្កើតជាកំពូលមុតស្រួចនៅ apex ត្រីកោណ ដែលធ្វើអោយ SPACA6 មានការរមួលជាង IZUMO1 ជាមួយនឹងត្រីកោណបែហោងធ្មែញកាន់តែច្បាស់។លើសពីនេះទៀត IZUMO1 ខ្វះ Arg37 សង្កេតឃើញនៅកណ្តាលនៃបែហោងធ្មែញនេះនៅក្នុង SPACA6 ។ផ្ទុយទៅវិញ IZUMO1 មានស្នូល hydrophobic ធម្មតាជាងនៃសំណល់ aliphatic និងក្លិនក្រអូប។
IZUMO1 មានដែនដូច Ig ដែលរួមមាន β-sheet43 ដែលមានខ្សែពីរ និងប្រាំខ្សែ។ខ្សែបន្ថែមនៅក្នុង IZUMO1 ជំនួសឧបករណ៏នៅក្នុង SPACA6 ដែលធ្វើអន្តរកម្មជាមួយខ្សែ F ដើម្បីកំណត់ចំណងអ៊ីដ្រូសែនឆ្អឹងខ្នងនៅក្នុងខ្សែ។ចំណុចគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយនៃការប្រៀបធៀបគឺបន្ទុកលើផ្ទៃដែលបានព្យាករណ៍នៃដែន Ig-like នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរ។ផ្ទៃ IZUMO1 ត្រូវបានចោទប្រកាន់អវិជ្ជមានច្រើនជាងផ្ទៃ SPACA6 ។បន្ទុកបន្ថែមមានទីតាំងនៅជិត C-terminus ដែលប្រឈមមុខនឹងភ្នាសមេជីវិតឈ្មោល។នៅក្នុង SPACA6 តំបន់ដូចគ្នាត្រូវបានចោទប្រកាន់ដោយអព្យាក្រឹត ឬវិជ្ជមាន (រូបភាព S8e)។ឧទាហរណ៍ ផ្ទៃ hydrophobic (គែមស្តើង) និងរណ្តៅដែលមានបន្ទុកវិជ្ជមាន (គែមធំទូលាយ) នៅក្នុង SPACA6 ត្រូវបានចោទប្រកាន់អវិជ្ជមាននៅក្នុង IZUMO1 ។
ទោះបីជាទំនាក់ទំនង និងធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំរវាង IZUMO1 និង SPACA6 ត្រូវបានរក្សាយ៉ាងល្អក៏ដោយ ការតម្រឹមរចនាសម្ព័ន្ធនៃដែនដូច Ig បានបង្ហាញថា ដែនទាំងពីរមានភាពខុសគ្នានៅក្នុងការតំរង់ទិសទូទៅរបស់ពួកគេទាក់ទងនឹងគ្នាទៅវិញទៅមក (រូបភាព S9) ។បាច់វង់នៃ IZUMO1 ត្រូវបានកោងអំពី β-sandwich បង្កើតរូបរាង "boomerang" ដែលបានពិពណ៌នាពីមុននៅប្រហែល 50 °ពីអ័ក្សកណ្តាល។ផ្ទុយទៅវិញ ធ្នឹមអេលីបនៅក្នុង SPACA6 ត្រូវបានផ្អៀងប្រហែល 10° ក្នុងទិសដៅផ្ទុយ។ភាពខុសគ្នានៃការតំរង់ទិសទាំងនេះទំនងជាដោយសារតែភាពខុសគ្នានៅក្នុងតំបន់ hinge ។នៅកម្រិតលំដាប់បឋម IZUMO1 និង SPACA6 ចែករំលែកភាពស្រដៀងគ្នានៃលំដាប់តិចតួចនៅហ៊ីង ដោយលើកលែងតែសំណល់អាស៊ីត cysteine, glycine និង aspartic ។ជាលទ្ធផលចំណងអ៊ីដ្រូសែននិងបណ្តាញអេឡិចត្រូស្ទិចគឺខុសគ្នាទាំងស្រុង។ធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ β-sheet ត្រូវបានចែករំលែកដោយ IZUMO1 និង SPACA6 ទោះបីជាខ្សែសង្វាក់នៅក្នុង IZUMO1 វែងជាង និង helix 310 (helix 5) មានតែមួយគត់សម្រាប់ SPACA6 ។ភាពខុសគ្នាទាំងនេះនាំឱ្យមានការតំរង់ទិសដែនផ្សេងៗគ្នាសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនស្រដៀងគ្នាពីរផ្សេងទៀត។
ការស្វែងរកម៉ាស៊ីនមេ Dali របស់យើងបានបង្ហាញថា SPACA6 និង IZUMO1 គឺជារចនាសម្ព័ន្ធដែលបានកំណត់ដោយពិសោធន៍តែពីរប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីនដែលមានផ្នត់ 4HB ពិសេសនេះ (តារាង S1) ។ថ្មីៗនេះ DeepMind (Alphabet/Google) បានបង្កើត AlphaFold ដែលជាប្រព័ន្ធផ្អែកលើបណ្តាញសរសៃប្រសាទដែលអាចទស្សន៍ទាយបានត្រឹមត្រូវអំពីរចនាសម្ព័ន្ធ 3D នៃប្រូតេអ៊ីនពីលំដាប់បឋម 48 ។មិនយូរប៉ុន្មានបន្ទាប់ពីយើងបានដោះស្រាយរចនាសម្ព័ន្ធ SPACA6 មូលដ្ឋានទិន្នន័យ AlphaFold ត្រូវបានចេញផ្សាយ ដោយផ្តល់នូវគំរូរចនាសម្ព័ន្ធព្យាករណ៍ដែលគ្របដណ្តប់ 98.5% នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់នៅក្នុង proteome48,49 របស់មនុស្ស។ដោយប្រើរចនាសម្ព័ន្ធ SPACA6 ដែលបានដោះស្រាយរបស់យើងជាគំរូស្វែងរក ការស្វែងរករចនាសម្ព័ន្ធដូចគ្នាសម្រាប់គំរូនៅក្នុង Proteome មនុស្ស AlphaFold បានកំណត់បេក្ខជនដែលមានភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធទៅនឹង SPACA6 និង IZUMO1 ។ដោយទទួលបានភាពត្រឹមត្រូវមិនគួរឱ្យជឿនៃ AlphaFold ក្នុងការទស្សន៍ទាយ SPACA6 (Fig ។ S10a) ជាពិសេស 1.1 Å rms ectodomain បើប្រៀបធៀបទៅនឹងរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានដោះស្រាយរបស់យើង (រូបភាព S10b) យើងអាចជឿជាក់បានថាការផ្គូផ្គង SPACA6 ដែលបានកំណត់ទំនងជាមានភាពត្រឹមត្រូវ។
ពីមុន PSI-BLAST បានស្វែងរកចង្កោម IZUMO1 ជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងមេជីវិតឈ្មោលបីផ្សេងទៀត៖ IZUMO2, IZUMO3 និង IZUMO450។AlphaFold បានព្យាករណ៍ថាប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារ IZUMO ទាំងនេះបត់ចូលទៅក្នុងដែន 4HB ជាមួយនឹងគំរូចំណង disulfide ដូចគ្នានឹង IZUMO1 (រូបភាព 3a និង S11) ទោះបីជាពួកគេខ្វះដែនដូច Ig ក៏ដោយ។វាត្រូវបានគេសន្មត់ថា IZUMO2 និង IZUMO3 គឺជាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសម្ខាងស្រដៀងទៅនឹង IZUMO1 ខណៈពេលដែល IZUMO4 ហាក់ដូចជាត្រូវបានសម្ងាត់។មុខងាររបស់ប្រូតេអ៊ីន IZUMO 2, 3 និង 4 នៅក្នុងការលាយ gamete មិនត្រូវបានកំណត់ទេ។IZUMO3 ត្រូវបានគេដឹងថាដើរតួរក្នុងជីវហ្សែន acrosome កំឡុងពេលបង្កើតមេជីវិតឈ្មោល 51 ហើយប្រូតេអ៊ីន IZUMO បង្កើតជាស្មុគស្មាញ 50 ។ការអភិរក្សប្រូតេអ៊ីន IZUMO នៅក្នុងថនិកសត្វ សត្វល្មូន និងសត្វ amphibians បង្ហាញថាមុខងារសក្តានុពលរបស់ពួកគេគឺស្របជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធ gamete-fusion-ដែលគេស្គាល់ផ្សេងទៀតដូចជា DCST1/2, SOF1 និង FIMP ។
ដ្យាក្រាមនៃស្ថាបត្យកម្មដែននៃគ្រួសារ IST ដែលមាន 4HB, hinge, និង Ig-like domains ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ទឹកក្រូច បៃតង និងពណ៌ខៀវរៀងៗខ្លួន។IZUMO4 មានតំបន់ C-terminal តែមួយគត់ដែលមើលទៅខ្មៅ។ចំណង disulfide បញ្ជាក់ និង putative ត្រូវបានបង្ហាញដោយបន្ទាត់រឹង និងចំនុចរៀងៗខ្លួន។b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLTM8-F95Al) និង DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) ត្រូវបានបង្ហាញក្នុងជួរពណ៌ដូចគ្នានឹងបន្ទះ A. ចំណង Disulfide ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ស្វាយ។TMEM95, IZUMO2 និង IZUMO3 transmembrane helices មិនត្រូវបានបង្ហាញទេ។
មិនដូចប្រូតេអ៊ីន IZUMO ប្រូតេអ៊ីន SPACA ផ្សេងទៀត (ឧទាហរណ៍ SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 និង SPACA9) ត្រូវបានគេគិតថាមានលក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធខុសពី SPACA6 (រូបភាព S12)។មានតែ SPACA9 ប៉ុណ្ណោះដែលមាន 4HB ប៉ុន្តែវាមិនត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងមានទិសដៅប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាឡែលដូចគ្នា ឬចំណង disulfide ដូច SPACA6 នោះទេ។មានតែ SPACA1 ប៉ុណ្ណោះដែលមានដែនស្រដៀងនឹង Ig ។AlphaFold ព្យាករណ៍ថា SPACA3, SPACA4 និង SPACA5 មានរចនាសម្ព័ន្ធខុសគ្នាទាំងស្រុងពី SPACA6 ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ SPACA4 ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាដើរតួក្នុងការបង្កកំណើតប៉ុន្តែក្នុងកម្រិតធំជាង SPACA6 ជំនួសវិញដែលជួយសម្រួលដល់អន្តរកម្មរវាងមេជីវិតឈ្មោលនិង oocyte zona pellucida52 ។
ការស្វែងរក AlphaFold របស់យើងបានរកឃើញការប្រកួតមួយផ្សេងទៀតសម្រាប់ IZUMO1 និង SPACA6 4HB, TMEM95 ។TMEM95 ដែលជាប្រូតេអ៊ីនចម្លងតាមមេជីវិតឈ្មោលតែមួយ ធ្វើឱ្យសត្វកណ្ដុរឈ្មោលមិនអាចមានកូននៅពេលមានការថយចុះ 32,33 ។មេជីវិតឈ្មោលដែលខ្វះ TMEM95 មានសរីរវិទ្យា ចលនាធម្មតា និងសមត្ថភាពក្នុងការជ្រាបចូលទៅក្នុង zona pellucida និងភ្ជាប់ទៅនឹងភ្នាសស៊ុត ប៉ុន្តែមិនអាចបញ្ចូលគ្នាជាមួយភ្នាស oocyte បានទេ។ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថា TMEM95 ចែករំលែកភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធជាមួយ IZUMO133 ។ជាការពិតណាស់ ម៉ូដែល AlphaFold បានបញ្ជាក់ថា TMEM95 គឺជា 4HB ដែលមានគំនូរ CXXC ដូចគ្នាជាមួយ IZUMO1 និង SPACA6 និងចំណង disulfide បន្ថែមដូចគ្នារវាង helices 1 និង 2 ដែលបានរកឃើញនៅក្នុង SPACA6 (រូបភាព 3a និង S11)។ទោះបីជា TMEM95 ខ្វះដែនដូច Ig ក៏ដោយ វាមានតំបន់ដែលមានលំនាំចំណង disulfide ស្រដៀងនឹងតំបន់ SPACA6 និង IZUMO1 hinge (រូបភាព 3b) ។នៅពេលបោះពុម្ពសាត្រាស្លឹករឹតនេះ ម៉ាស៊ីនមេបោះពុម្ពជាមុនបានរាយការណ៍អំពីរចនាសម្ព័ន្ធរបស់ TMEM95 ដោយបញ្ជាក់ពីលទ្ធផល AlphaFold53។TMEM95 គឺស្រដៀងទៅនឹង SPACA6 និង IZUMO1 ហើយត្រូវបានអភិរក្សដោយវិវឌ្ឍរួចហើយនៅក្នុងសត្វមច្ឆា (រូបភាពទី 4 និង S13)។
ការស្វែងរក PSI-BLAST បានប្រើមូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP និង SOF1 ដើម្បីកំណត់ទីតាំងនៃលំដាប់ទាំងនេះនៅក្នុងដើមឈើជីវិត។ចម្ងាយរវាងចំណុចសាខាមិនត្រូវបានបង្ហាញជាមាត្រដ្ឋានទេ។
ភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធទាំងមូលដ៏គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍រវាង SPACA6 និង IZUMO1 បង្ហាញថាពួកគេកំពុងបង្កើតសមាជិកនៃក្រុមគ្រួសាររចនាសម្ព័ន្ធដែលត្រូវបានអភិរក្សដែលរួមមានប្រូតេអ៊ីន TMEM95 និង IZUMO 2, 3 និង 4 ។សមាជិកដែលគេស្គាល់៖ IZUMO1, SPACA6 និង TMEM95។ដោយសារតែសមាជិកមួយចំនួនមានដែនដូច Ig ចំណុចសំខាន់នៃគ្រួសារ IST គឺដែន 4HB ដែលមានលក្ខណៈពិសេសប្លែកពីគេចំពោះប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់នេះ៖ 1) Coiled 4HB ជាមួយ helices បានរៀបចំនៅក្នុងការឆ្លាស់គ្នាប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាឡែល/ប៉ារ៉ាឡែល (រូបភាព . 5a), 2) បណ្តុំមានមុខរាងត្រីកោណដែលមានពីរនៅក្នុងបាច់ និង helix បញ្ឈរទីបី (តំបន់គន្លឹះ (រូបភាព 5c)) ។ គំនូរ CXXC ដែលមាននៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនដូច thioredoxin ត្រូវបានគេដឹងថាមានមុខងារ ជាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា redox 54,55,56 ខណៈពេលដែលគំនូរនៅក្នុងសមាជិកគ្រួសារ IST អាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីន disulfide isomerase ដូចជា ERp57 នៅក្នុងការលាយ gamete ។ តួនាទីត្រូវបានភ្ជាប់ 57,58 ។
សមាជិកនៃគ្រួសារ IST ត្រូវបានកំណត់ដោយលក្ខណៈពិសេសបីនៃដែន 4HB: កែងជើងចំនួនបួនដែលឆ្លាស់គ្នារវាងការតំរង់ទិសប៉ារ៉ាឡែល និងប្រឆាំងប៉ារ៉ាឡែល មុខបណ្តុំរាងត្រីកោណ ba-ត្រីកោណ និងគំនូរទ្វេ ca CXXC ដែលបង្កើតឡើងរវាងម៉ូលេគុលតូចៗ។) N-terminal helixes (ពណ៌ទឹកក្រូច) និង hinge region β-hairpin (បៃតង) ។
ដោយសារភាពស្រដៀងគ្នារវាង SPACA6 និង IZUMO1 សមត្ថភាពរបស់អតីតក្នុងការចងជាមួយ IZUMO1 ឬ JUNO ត្រូវបានសាកល្បង។Biolayer interferometry (BLI) គឺជាវិធីសាស្រ្តចងផ្អែកលើ kinetic ដែលពីមុនត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់បរិមាណអន្តរកម្មរវាង IZUMO1 និង JUNO ។បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់នៃឧបករណ៏ដែលមានស្លាក biotin ជាមួយ IZUMO1 ជានុយដែលមានកំហាប់ខ្ពស់នៃ JUNO analyte សញ្ញាខ្លាំងត្រូវបានរកឃើញ (រូបភាព S14a) ដែលបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរដែលបណ្ដាលមកពីការចងនៅក្នុងកម្រាស់នៃ biomaterial ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងចុងរបស់ sensor ។សញ្ញាស្រដៀងគ្នា (ឧទាហរណ៍ JUNO ភ្ជាប់ជាមួយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាជានុយប្រឆាំងនឹងអ្នកវិភាគ IZUMO1) (រូបភាព S14b) ។គ្មានសញ្ញាត្រូវបានរកឃើញនៅពេលដែល SPACA6 ត្រូវបានប្រើជាការវិភាគប្រឆាំងនឹងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា IZUMO1 ឬចាប់សញ្ញា JUNO (រូបភាព S14a, ខ) ។អវត្ដមាននៃសញ្ញានេះបង្ហាញថាដែន extracellular នៃ SPACA6 មិនមានអន្តរកម្មជាមួយដែន extracellular នៃ IZUMO1 ឬ JUNO ទេ។
ដោយសារតែការវិភាគ BLI គឺផ្អែកលើការធ្វើ biotinylation នៃសំណល់ lysine ដោយឥតគិតថ្លៃនៅលើប្រូតេអ៊ីននុយ ការកែប្រែនេះអាចការពារការចង ប្រសិនបើសំណល់ lysine ត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងអន្តរកម្ម។លើសពីនេះទៀត ការតំរង់ទិសនៃការចងទាក់ទងទៅនឹងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាអាចបង្កើតឧបសគ្គស្តេរីក ដូច្នេះការវិភាគទាញចុះក្រោមធម្មតាក៏ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ ectodomains SPACA6, IZUMO1 និង JUNO ដែលត្រូវបានផ្សំឡើងវិញផងដែរ។ទោះបីជាយ៉ាងនេះក៏ដោយ SPACA6 មិនបានធ្លាក់ចុះជាមួយ IZUMO1 ឬ JUNO ដែលមានស្លាករបស់គាត់ (រូបភាព S14c, d) ដោយបង្ហាញថាមិនមានអន្តរកម្មស្របតាមអ្វីដែលបានសង្កេតនៅក្នុងការពិសោធន៍ BLI ទេ។ក្នុងនាមជាការត្រួតពិនិត្យជាវិជ្ជមាន យើងបានបញ្ជាក់ពីអន្តរកម្មរបស់ JUNO ជាមួយនឹងការដាក់ស្លាករបស់គាត់ថា IZUMO1 (រូបភាព S14e និង S15) ។
ទោះបីជាមានភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធរវាង SPACA6 និង IZUMO1 ក៏ដោយ អសមត្ថភាពរបស់ SPACA6 ដើម្បីចង JUNO មិនគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលនោះទេ។ផ្ទៃនៃ IZUMO1 របស់មនុស្សមានច្រើនជាង 20 សំណល់ដែលមានអន្តរកម្មជាមួយ JUNO រួមទាំងសំណល់ពីតំបន់នីមួយៗនៃតំបន់ទាំងបី (ទោះបីជាភាគច្រើននៃពួកវាមានទីតាំងនៅក្នុងតំបន់ហ៊ីង) (រូបភាព S14f) ។ក្នុងចំណោមសំណល់ទាំងនេះ មានតែមួយប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុង SPACA6 (Glu70)។ខណៈពេលដែលការជំនួសសំណល់ជាច្រើនរក្សាបាននូវលក្ខណៈសម្បត្តិជីវគីមីដើមរបស់វា សំណល់ Arg160 សំខាន់ៗនៅក្នុង IZUMO1 ត្រូវបានជំនួសដោយ Asp148 ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់អវិជ្ជមាននៅក្នុង SPACA6;ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរ Arg160Glu នៅក្នុង IZUMO1 ស្ទើរតែលុបបំបាត់ទាំងស្រុងនូវការភ្ជាប់ទៅនឹង JUNO43 ។លើសពីនេះ ភាពខុសគ្នានៃការតំរង់ទិសដែនរវាង IZUMO1 និង SPACA6 បានបង្កើនយ៉ាងខ្លាំងនូវផ្ទៃនៃតំបន់ភ្ជាប់ JUNO នៃតំបន់សមមូលនៅលើ SPACA6 (រូបភាព S14g) ។
ទោះបីជាតម្រូវការដែលគេស្គាល់សម្រាប់ SPACA6 សម្រាប់ការបញ្ចូលគ្នានៃ gamete និងភាពស្រដៀងគ្នារបស់វាទៅនឹង IZUMO1 ក៏ដោយ SPACA6 ហាក់ដូចជាមិនមានមុខងារចង JUNO ដែលស្មើនឹងនោះទេ។ដូច្នេះហើយ យើងបានស្វែងរកការបញ្ចូលគ្នានូវទិន្នន័យរចនាសម្ព័ន្ធរបស់យើងជាមួយនឹងភស្តុតាងនៃសារៈសំខាន់ដែលផ្តល់ដោយជីវវិទ្យាវិវត្តន៍។ការតម្រឹមតាមលំដាប់នៃ SPACA6 homologues បង្ហាញពីការអភិរក្សរចនាសម្ព័ន្ធទូទៅលើសពីថនិកសត្វ។ឧទាហរណ៍ សំណល់ cysteine ​​​​មានវត្តមានសូម្បីតែនៅក្នុង amphibians ដែលទាក់ទងឆ្ងាយ (រូបភាព 6a) ។ដោយប្រើម៉ាស៊ីនមេ ConSurf ទិន្នន័យរក្សាការតម្រឹមតាមលំដាប់ជាច្រើននៃ 66 លំដាប់ត្រូវបានគូសផែនទីទៅលើផ្ទៃ SPACA6 ។ប្រភេទនៃការវិភាគនេះអាចបង្ហាញថាតើសំណល់មួយណាត្រូវបានអភិរក្សកំឡុងពេលវិវឌ្ឍន៍ប្រូតេអ៊ីន និងអាចចង្អុលបង្ហាញថាតើផ្ទៃណាមួយដែលដើរតួក្នុងមុខងារ។
ការតម្រឹមតាមលំដាប់នៃ SPACA6 ectodomains ពី 12 ប្រភេទផ្សេងគ្នាដែលបានរៀបចំដោយប្រើ CLUSTAL OMEGA ។យោងតាមការវិភាគ ConSurf មុខតំណែងអភិរក្សភាគច្រើនត្រូវបានសម្គាល់ជាពណ៌ខៀវ។សំណល់ cysteine ​​​​ត្រូវបានបន្លិចជាពណ៌ក្រហម។ព្រំប្រទល់ដែន និងធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំត្រូវបានបង្ហាញនៅផ្នែកខាងលើនៃការតម្រឹម ដែលសញ្ញាព្រួញបង្ហាញ β-strands និងរលកបង្ហាញពី helices ។គ្រឿងសម្គាល់ការចូលប្រើរបស់ NCBI ដែលមានលំដាប់លំដោយគឺ៖ មនុស្ស (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), ស្វា capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), សេះ (Equus12012366), សេះ (Equus 12235), សេះ _23 XP_032_034) ។), ចៀម (Ovis aries, XP_014955560), ដំរី (Loxodonta africana, XP_010585293), ឆ្កែ (Canis lupus familyis, XP_025277208), កណ្ដុរ (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (Sarcophii, XP_031, 11156381) s, 8) , 61_89 និង Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113) ។លេខរៀងគឺផ្អែកលើលំដាប់របស់មនុស្ស។b តំណាងផ្ទៃនៃរចនាសម្ព័ន្ធ SPACA6 ជាមួយ 4HB នៅផ្នែកខាងលើ និងដែនដូច Ig នៅខាងក្រោម ពណ៌ដោយផ្អែកលើការប៉ាន់ស្មានការអភិរក្សពីម៉ាស៊ីនមេ ConSurf ។ផ្នែកដែលរក្សាបានល្អបំផុតមានពណ៌ខៀវ ផ្នែកដែលរក្សាទុកកម្រិតមធ្យមមានពណ៌ស ហើយការរក្សាទុកតិចបំផុតមានពណ៌លឿង។ស៊ីស្ទីនពណ៌ស្វាយ។បំណះលើផ្ទៃចំនួនបីដែលបង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់នៃការការពារត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងបំណះដែលមានស្លាកលេខ 1, 2 និង 3។ រូបថ្លុក 4HB ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងប្រអប់នៅខាងស្តាំខាងលើ (ពណ៌ចម្រុះដូចគ្នា)។
រចនាសម្ព័ន SPACA6 មានផ្ទៃបីដែលត្រូវបានអភិរក្សខ្ពស់ (រូបភាព 6b) ។បំណះ 1 លាតសន្ធឹង 4HB និងតំបន់ hinge និងមានស្ពាន CXXC disulfide ដែលត្រូវបានអភិរក្សចំនួនពីរ បណ្តាញ hinge Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (រូបភាព S7) និងសំណល់ក្រអូបខាងក្រៅដែលបានអភិរក្សចំនួនបី (Phe31, Tyr73, Phe137)។គែមធំទូលាយនៃដែនដូច Ig (រូបភាព S6e) ដែលតំណាងឱ្យសំណល់ដែលត្រូវបានចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមានជាច្រើនលើផ្ទៃមេជីវិតឈ្មោល។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ បំណះនេះមានផ្ទុកអេពីតូបអង្គបដិប្រាណដែលត្រូវបានបង្ហាញពីមុនថារំខានដល់មុខងារ SPACA6 30 ។តំបន់ទី 3 លាតសន្ធឹងលើហ៊ីង និងផ្នែកម្ខាងនៃដែនដូច Ig;តំបន់នេះមានសារធាតុប្រូលីនដែលបានអភិរក្ស (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) និងសំណល់ប៉ូលដែលប្រឈមមុខនឹងខាងក្រៅ។គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល ភាគច្រើននៃសំណល់នៅលើផ្ទៃ 4HB គឺមានភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ (រូបភាព 6b) ទោះបីជាផ្នត់ត្រូវបានអភិរក្សទូទាំង SPACA6 homologue (ដូចដែលបានបង្ហាញដោយការអភិរក្សនៃស្នូលបណ្តុំ hydrophobic) និងលើសពី IST superfamily ។
ទោះបីជានេះជាតំបន់តូចបំផុតនៅក្នុង SPACA6 ដែលមានធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដែលអាចរកឃើញបានតិចតួចបំផុតក៏ដោយ ប៉ុន្តែសំណល់នៃតំបន់ hinge ជាច្រើន (រួមទាំងតំបន់ទី 3) ត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងខ្លាំងក្នុងចំណោម SPACA6 homologues ដែលអាចបង្ហាញថាការតំរង់ទិសនៃបណ្តុំ helical និង β-sandwich ដើរតួនាទីមួយ។ជាអ្នកអភិរក្ស។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាមានការភ្ជាប់អ៊ីដ្រូសែន និងបណ្តាញអេឡិចត្រូស្ទិកយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងតំបន់ hinge នៃ SPACA6 និង IZUMO1 ក៏ដោយ ភស្តុតាងនៃភាពបត់បែនខាងក្នុងអាចមើលឃើញនៅក្នុងការតម្រឹមនៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលអនុញ្ញាតច្រើននៃ IZUMO137,43,44 ។ការតម្រឹមនៃដែននីមួយៗត្រួតលើគ្នាយ៉ាងល្អ ប៉ុន្តែការតំរង់ទិសនៃដែនដែលទាក់ទងគ្នាទៅវិញទៅមកប្រែប្រួលពី 50° ទៅ 70° ពីអ័ក្សកណ្តាល (រូបភាព S16) ។ដើម្បីស្វែងយល់ពីសក្ដានុពលនៃអនុលោមភាពនៃ SPACA6 នៅក្នុងដំណោះស្រាយ ការពិសោធន៍ SAXS ត្រូវបានអនុវត្ត (រូបភាព S17a, ខ) ។Ab initio ការកសាងឡើងវិញនៃ SPACA6 ectodomain អនុលោមតាមរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់ដំបង (រូបភាព S18) ទោះបីជាគ្រោង Kratky បានបង្ហាញពីភាពបត់បែនមួយចំនួន (រូបភាព S17b) ។ការអនុលោមភាពនេះផ្ទុយទៅនឹង IZUMO1 ដែលប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមានព្រំដែនសន្មត់ថាជារូបរាង boomerang ទាំងនៅក្នុងបន្ទះឈើ និងនៅក្នុងដំណោះស្រាយ43។
ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណតំបន់ដែលអាចបត់បែនបានជាពិសេស ការផ្លាស់ប្តូរម៉ាស់ spectroscopy អ៊ីដ្រូសែន-ឌឺតេរីម (H-DXMS) ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ SPACA6 ហើយប្រៀបធៀបជាមួយទិន្នន័យដែលទទួលបានពីមុននៅលើ IZUMO143 (រូបភាព 7a, ខ) ។SPACA6 គឺច្បាស់ជាអាចបត់បែនបានជាង IZUMO1 ដូចដែលបានបង្ហាញដោយការផ្លាស់ប្តូរ deuterium ខ្ពស់ជាងនៅទូទាំងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់ពីការផ្លាស់ប្តូរ 100,000 s ។នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងពីរ ផ្នែក C-terminal នៃតំបន់ hinge បង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់នៃការផ្លាស់ប្តូរ ដែលប្រហែលជាអនុញ្ញាតឱ្យមានការបង្វិលមានកំណត់នៃ 4HB និង Ig-like domains ដែលទាក់ទងគ្នាទៅវិញទៅមក។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ផ្នែក C-terminal នៃ hinge SPACA6 ដែលមានសំណល់ 147CDLPLDCP154 គឺជាតំបន់ដែលត្រូវបានរក្សាទុកយ៉ាងខ្លាំង 3 (រូបភាព 6b) ដែលអាចបង្ហាញថាភាពបត់បែនរបស់ interdomain គឺជាមុខងារអភិរក្សវិវត្តនៃ SPACA6 ។យោងតាមការវិភាគភាពបត់បែនទិន្នន័យនៃការរលាយកំដៅស៊ីឌីបានបង្ហាញថា SPACA6 (Tm = 51.2 °C) មានស្ថេរភាពតិចជាង IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (រូបភាព S1e និង S19) ។
រូបភាព H-DXMS នៃ SPACA6 និង b IZUMO1 ។ភាគរយនៃការផ្លាស់ប្តូរ deuterium ត្រូវបានកំណត់តាមពេលវេលាដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។កម្រិតនៃការផ្លាស់ប្តូរអ៊ីដ្រូសែន-ឌឺតេរីម ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញដោយពណ៌នៅលើមាត្រដ្ឋានជម្រាលពីពណ៌ខៀវ (10%) ទៅក្រហម (90%) ។ប្រអប់ខ្មៅតំណាងឱ្យតំបន់នៃការផ្លាស់ប្តូរខ្ពស់។ព្រំដែននៃ 4HB, hinge និង Ig-like domain ដែលបានសង្កេតនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់ត្រូវបានបង្ហាញខាងលើលំដាប់បឋម។កម្រិតនៃការផ្លាស់ប្តូរ Deuterium នៅ 10 s, 1000 s និង 100,000 s ត្រូវបានគេគ្រោងនៅលើគំនូសតាងបន្ទះដែលដាក់លើផ្ទៃម៉ូលេគុលថ្លានៃ SPACA6 និង IZUMO1 ។ផ្នែកនៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលមានកម្រិតផ្លាស់ប្តូរ deuterium ក្រោម 50% មានពណ៌ស។តំបន់លើសពី 50% ការផ្លាស់ប្តូរ H-DXMS ត្រូវបានលាបពណ៌ក្នុងមាត្រដ្ឋានជម្រាល។
ការប្រើប្រាស់ CRISPR/Cas9 និងយុទ្ធសាស្ត្រហ្សែនកណ្ដុរចេញពីហ្សែនបាននាំឱ្យមានការកំណត់អត្តសញ្ញាណកត្តាជាច្រើនដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការភ្ជាប់មេជីវិតឈ្មោល និងស៊ុត និងការបញ្ចូលគ្នា។ក្រៅពីអន្តរកម្មលក្ខណៈល្អនៃរចនាសម្ព័ន្ធ IZUMO1-JUNO និង CD9 ប្រូតេអ៊ីនភាគច្រើនដែលទាក់ទងនឹងការលាយ gamete នៅតែមានលក្ខណៈជារចនាសម្ព័ន្ធ និងមុខងារ។លក្ខណៈជីវរូបវិទ្យា និងរចនាសម្ព័ន្ធនៃ SPACA6 គឺជាបំណែកមួយទៀតនៃរូបផ្គុំម៉ូលេគុល adhesion/fusion កំឡុងពេលបង្កកំណើត។
SPACA6 និងសមាជិកដទៃទៀតនៃគ្រួសារ IST ហាក់ដូចជាត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងថនិកសត្វ ក៏ដូចជាសត្វស្លាប សត្វល្មូន និងសត្វ amphibians ។តាមការពិត វាត្រូវបានគេគិតថា SPACA6 ថែមទាំងត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបង្កកំណើតនៅក្នុងត្រី zebrafish 59។ ការចែកចាយនេះគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ gamete ដែលគេស្គាល់ផ្សេងទៀតដូចជា DCST134, DCST234, FIMP31, និង SOF132 ដែលបង្ហាញថាកត្តាទាំងនេះគឺកង្វះ HAP2 (ផងដែរ ត្រូវបានគេស្គាល់ថាជា GCS1) ប្រូតេអ៊ីនដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះសកម្មភាពកាតាលីកររបស់ប្រូទីសជាច្រើន។រុក្ខជាតិ និង arthropods ។ប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នាដែលមានជីជាតិ 60, 61។ ទោះបីជាមានភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធខ្លាំងរវាង SPACA6 និង IZUMO1 ក៏ដោយ ការទម្លាក់ហ្សែនដែលអ៊ិនកូដប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះបណ្តាលឱ្យមានភាពគ្មានកូននៅក្នុងសត្វកណ្តុរឈ្មោល ដែលបង្ហាញថាមុខងាររបស់ពួកគេនៅក្នុងការលាយបញ្ចូលគ្នារវាង gamete មិនត្រូវបានចម្លងទេ។.កាន់តែទូលំទូលាយ គ្មានប្រូតេអ៊ីនមេជីវិតឈ្មោលដែលគេស្គាល់ថាត្រូវការសម្រាប់ដំណាក់កាលស្អិតជាប់នៃការលាយបញ្ចូលគ្នាគឺមិនអាចខ្វះបានឡើយ។
វានៅតែជាសំណួរបើកចំហថាតើ SPACA6 (និងសមាជិកផ្សេងទៀតនៃគ្រួសារ IST) ចូលរួមក្នុងការប្រសព្វអន្តរការី បង្កើតបណ្តាញ intragametic ដើម្បីជ្រើសរើសប្រូតេអ៊ីនសំខាន់ៗទៅកាន់ចំណុចបញ្ចូលគ្នា ឬប្រហែលជាសូម្បីតែដើរតួជា fusogens ពិបាកយល់។ការសិក្សារួមគ្នា immunoprecipitation នៅក្នុងកោសិកា HEK293T បានបង្ហាញពីអន្តរកម្មរវាងប្រវែងពេញលេញ IZUMO1 និង SPACA632 ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ectodomains recombinant របស់យើងមិនមានអន្តរកម្មនៅក្នុង vitro ដោយបង្ហាញថាអន្តរកម្មដែលបានឃើញនៅក្នុង Noda et al ។ត្រូវ​បាន​លុប​ទាំង​ពីរ​នៅ​ក្នុង​ការ​សាង​សង់ (ចំណាំ​កន្ទុយ cytoplasmic នៃ IZUMO1 ដែល​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​ថា​ជា​ការ​មិន​ចាំបាច់​សម្រាប់​ការ​បង្ក​កំណើត 62) ។ម៉្យាងទៀត IZUMO1 និង/ឬ SPACA6 អាចទាមទារបរិយាកាសចងជាក់លាក់ដែលយើងមិនបង្កើតឡើងវិញនៅក្នុង vitro ដូចជាការអនុលោមតាមលក្ខណៈសរីរវិទ្យា ឬស្មុគស្មាញម៉ូលេគុលដែលមានប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត (ស្គាល់ ឬមិនទាន់រកឃើញ)។ទោះបីជា IZUMO1 ectodomain ត្រូវបានគេជឿថាដើម្បីសម្របសម្រួលការភ្ជាប់មេជីវិតឈ្មោលទៅនឹងស៊ុតនៅក្នុងចន្លោះ perivitelline ក៏ដោយ គោលបំណងនៃ SPACA6 ectodomain គឺមិនច្បាស់លាស់។
រចនាសម្ព័នរបស់ SPACA6 បង្ហាញពីផ្ទៃដែលត្រូវបានអភិរក្សជាច្រើន ដែលអាចពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន។ផ្នែកដែលបានអភិរក្សនៃតំបន់ hinge ភ្លាមៗដែលនៅជាប់នឹងគំនូរ CXXC (កំណត់បំណះ 1 ខាងលើ) មានសំណល់ក្លិនក្រអូបដែលប្រឈមមុខនឹងខាងក្រៅជាច្រើន ដែលជារឿយៗត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងអន្តរកម្ម hydrophobic និង π-ជង់រវាងជីវម៉ូលេគុល។ផ្នែកធំទូលាយនៃដែនដូច Ig (តំបន់ទី 2) បង្កើតជាចង្អូរដែលមានការចោទប្រកាន់ជាវិជ្ជមានជាមួយនឹងសារធាតុ Arg និងសំណល់របស់គាត់ដែលត្រូវបានអភិរក្សខ្ពស់ ហើយអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹងតំបន់នេះពីមុនត្រូវបានគេប្រើដើម្បីទប់ស្កាត់ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ gamete 30 ។អង្គបដិប្រាណទទួលស្គាល់អេពីតូបលីនេអ៊ែរ 212RIRPAQLTHRGTFS225 ដែលមានសំណល់ arginine បីក្នុងចំណោមប្រាំមួយ និងរក្សាបានយ៉ាងខ្ពស់ His220 ។វាមិនច្បាស់ទេថាតើការមិនដំណើរការគឺដោយសារតែការស្ទះនៃសំណល់ជាក់លាក់ទាំងនេះ ឬតំបន់ទាំងមូល។ទីតាំងនៃគម្លាតនេះនៅជិត C-terminus នៃβ-sandwich បង្ហាញពីអន្តរកម្ម cis ជាមួយប្រូតេអ៊ីនមេជីវិតឈ្មោលដែលនៅជិតខាង ប៉ុន្តែមិនមែនជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីន oocyte ទេ។លើសពីនេះ ការរក្សាភាពច្របូកច្របល់ដែលសំបូរទៅដោយប្រូលីនដែលអាចបត់បែនបានខ្ពស់ (កន្លែងទី 3) នៅក្នុងហ៊ីងអាចជាទីតាំងនៃអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន ឬទំនងជាបង្ហាញពីការរក្សាភាពបត់បែនរវាងដែនទាំងពីរ។យេនឌ័រមានសារៈសំខាន់សម្រាប់តួនាទីមិនស្គាល់របស់ SPACA6។ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ gametes ។
SPACA6 មានលក្ខណៈសម្បត្តិនៃប្រូតេអ៊ីន adhesion intercellular រួមទាំង Ig-like β-sandwiches ។ប្រូតេអ៊ីន adhesive ជាច្រើន (ឧទាហរណ៍ cadherins, integrins, adhesins, និង IZUMO1) មានដែន β-sandwich មួយ ឬច្រើន ដែលពង្រីកប្រូតេអ៊ីនពីភ្នាសកោសិកាទៅកាន់គោលដៅបរិស្ថាន 63,64,65។ដែន Ig-like នៃ SPACA6 ក៏មានគំនូរដែលត្រូវបានរកឃើញជាទូទៅនៅក្នុង β-sandwiches នៃ adhesion and cohesion: doublets of parallel strands at the end of β-sandwiches, known as mechanical clamps66.វាត្រូវបានគេជឿថាគំនូរនេះបង្កើនភាពធន់ទ្រាំទៅនឹងកម្លាំងកាត់ដែលមានតម្លៃសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងអន្តរកម្មរវាងកោសិកា។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាភាពស្រដៀងគ្នានេះទៅនឹងសារធាតុ adhesins ក៏ដោយ ក៏បច្ចុប្បន្នមិនមានភស្តុតាងណាមួយដែលបង្ហាញថា SPACA6 មានអន្តរកម្មជាមួយស៊ុតពណ៌សនោះទេ។SPACA6 ectodomain មិនអាចចងជាមួយ JUNO បានទេ ហើយកោសិកា SPACA6-expressing HEK293T ដូចដែលបានបង្ហាញនៅទីនេះ ស្ទើរតែមិនធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ oocytes ដែលខ្វះ zona 32 ។ប្រសិនបើ SPACA6 បង្កើតចំណងអន្តរកម្ម អន្តរកម្មទាំងនេះអាចតម្រូវឱ្យមានការកែប្រែក្រោយការបកប្រែ ឬស្ថេរភាពដោយប្រូតេអ៊ីនមេជីវិតឈ្មោល។នៅក្នុងការគាំទ្រនៃសម្មតិកម្មចុងក្រោយ មេជីវិតឈ្មោលដែលខ្វះ IZUMO1 ភ្ជាប់ទៅនឹង oocytes ដែលបង្ហាញថាម៉ូលេគុលក្រៅពី IZUMO1 ត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការ adhesion gamete ជំហានទី 27 ។
ប្រូតេអុីនដែលផ្សំពីមេរោគ កោសិកា និងការអភិវឌ្ឍន៍ជាច្រើនមានលក្ខណៈសម្បត្តិដែលព្យាករណ៍ពីមុខងាររបស់វាជាហ្វូហ្សេន។ឧទាហរណ៍ glycoproteins fusion មេរោគ (ថ្នាក់ I, II និង III) មាន hydrophobic fusion peptide ឬរង្វិលជុំនៅចុងបញ្ចប់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងភ្នាសម៉ាស៊ីន។ផែនទី hydrophilicity នៃ IZUMO143 និងរចនាសម្ព័ន (កំណត់ និងព្យាករណ៍) នៃគ្រួសារ IST superfamily បានបង្ហាញមិនច្បាស់ថា hydrophobic fusion peptide ។ដូច្នេះប្រសិនបើប្រូតេអ៊ីនណាមួយនៅក្នុងគ្រួសារ IST ដំណើរការជា fusogens ពួកវាធ្វើដូច្នេះក្នុងលក្ខណៈខុសពីឧទាហរណ៍ដែលគេស្គាល់ផ្សេងទៀត។
សរុបមក មុខងាររបស់សមាជិកនៃក្រុម IST superfamily នៃប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងការលាយ gamete នៅតែជាអាថ៌កំបាំងដ៏គួរឱ្យភ័យខ្លាច។ម៉ូលេគុល SPACA6 recombinant លក្ខណៈរបស់យើង និងរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានដោះស្រាយរបស់វានឹងផ្តល់នូវការយល់ដឹងអំពីទំនាក់ទំនងរវាងរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានចែករំលែកទាំងនេះ និងតួនាទីរបស់ពួកគេក្នុងការភ្ជាប់ gamete និងការបញ្ចូលគ្នា។
លំដាប់ DNA ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹង SPACA6 ectodomain របស់មនុស្សដែលបានព្យាករណ៍ (លេខចូល NCBI NP_001303901.1; សំណល់ 27–246) ត្រូវបាន codon-optimized សម្រាប់ការបញ្ចេញមតិនៅក្នុងកោសិកា Drosophila melanogaster S2 ហើយត្រូវបានសំយោគជាបំណែកហ្សែនជាមួយនឹង sequence Kooscoding (Encoding)។សញ្ញាសម្ងាត់ BiP និង 5′ និង 3′ ដែលត្រូវគ្នានឹងបញ្ចប់សម្រាប់ការក្លូនឯករាជ្យនៃហ្សែននេះទៅជាវ៉ិចទ័រនៃការបញ្ចេញមតិ pMT ដោយផ្អែកលើអ្នកផ្សព្វផ្សាយ metallothionein ដែលបានកែប្រែសម្រាប់ការជ្រើសរើសជាមួយ puromycin (pMT-puro) ។វ៉ិចទ័រ pMT-puro អ៊ិនកូដគេហទំព័របំបែក thrombin តាមពីក្រោយដោយស្លាក 10x-His C-terminal (រូបភាព S2) ។
ការផ្ទេរស្ថេរភាពនៃវ៉ិចទ័រ SPACA6 pMT-puro ទៅក្នុងកោសិកា D. melanogaster S2 (Gibco) ត្រូវបានអនុវត្តស្រដៀងគ្នាទៅនឹងពិធីការដែលប្រើសម្រាប់ IZUMO1 និង JUNO43។កោសិកា S2 ត្រូវបានរលាយ និងលូតលាស់នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុករបស់ Schneider (Gibco) ដែលត្រូវបានបំពេញបន្ថែមជាមួយនឹងកំហាប់ចុងក្រោយនៃសេរ៉ូមកូនគោគភ៌ដែលមានកំដៅ 10% (v/v) និង 1X antimycotic antibiotic (Gibco) ។កោសិកាឆ្លងកាត់ដំបូង (កោសិកា 3.0 x 106) ត្រូវបានដាក់ក្នុងអណ្តូងនីមួយៗនៃចាន 6 អណ្តូង (Corning)។បន្ទាប់ពីរយៈពេល 24 ម៉ោងនៃការភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 27°C កោសិកាត្រូវបានចម្លងដោយល្បាយនៃវ៉ិចទ័រ SPACA6 pMT-puro 2 mg និង Effectene transfection reagent (Qiagen) យោងតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត។កោសិកាឆ្លងត្រូវបាន incubed រយៈពេល 72 ម៉ោងហើយបន្ទាប់មកប្រមូលផលជាមួយនឹង 6 mg/ml puromycin ។បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបានញែកចេញពីឧបករណ៍ផ្ទុក Schneider ពេញលេញ ហើយដាក់ក្នុងសេរ៉ូមគ្មានមេរោគ Insect-XPRESS medium (Lonza) សម្រាប់ការផលិតប្រូតេអ៊ីនខ្នាតធំ។បណ្តុំនៃវប្បធម៌កោសិកា S2 ចំនួន 1 លីត្រត្រូវបានដាំដុះទៅជាកោសិកា 8–10 × 106 ml-1 នៅក្នុងដបជ័រដែលមានខ្យល់ចេញចូល 2 លីត្រ អេលែនមេយឺ ហើយបន្ទាប់មកបានក្រៀវជាមួយនឹងកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) និងបានត្រងមាប់មគ។ជម្រុញ។វប្បធម៌ដែលត្រូវបានបំផុសគំនិតត្រូវបាន incubated នៅ 27 ° C. នៅ 120 rpm សម្រាប់រយៈពេលបួនថ្ងៃ។
ឧបករណ៍ផ្ទុកតាមលក្ខខណ្ឌដែលមាន SPACA6 ត្រូវបានញែកដាច់ដោយ centrifugation នៅ 5660 ×g នៅ 4 ° C អមដោយ Centramate flow tangential system (Pall Corp) ជាមួយនឹងភ្នាស 10 kDa MWCO ។លាបសារធាតុប្រមូលផ្តុំដែលមាន SPACA6 ទៅជួរឈរជ័រ Ni-NTA agarose (Qiagen) 2 មីលីលីត្រ។ជ័រ Ni-NTA ត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយនឹងបរិមាណជួរឈរ 10 (CV) នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន A ហើយបន្ទាប់មក 1 CV នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន A ត្រូវបានបន្ថែម ដើម្បីផ្តល់នូវកំហាប់ imidazole ចុងក្រោយនៃ 50 mM ។SPACA6 ត្រូវបាន eluted ជាមួយ 10 មីលីលីត្រនៃ buffer A បន្ថែមជាមួយ imidazole ដល់កំហាប់ចុងក្រោយនៃ 500 mM ។Restriction class thrombin (Millipore Sigma) ត្រូវបានបន្ថែមដោយផ្ទាល់ទៅក្នុងបំពង់លាងឈាម (MWCO 12-14 kDa) ក្នុងកម្រិត 1 ឯកតាក្នុងមួយមីលីក្រាម SPACA6 ទល់នឹង 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 និង 150 mM NaCl (buffer B) សម្រាប់ការលាងឈាម។) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 48 ម៉ោង។បន្ទាប់មក SPACA6 ដែលត្រូវបានសម្អាតដោយ thrombin ត្រូវបានពនឺបីដង ដើម្បីកាត់បន្ថយកំហាប់អំបិល ហើយផ្ទុកទៅលើ 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange column (Cytiva/GE) ដែលមានលំនឹងជាមួយ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ។ឧបករណ៍ផ្លាស់ប្តូរ cation ត្រូវបានលាងសម្អាតដោយ 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 បន្ទាប់មក SPACA6 ត្រូវបាន eluted ជាមួយជម្រាលលីនេអ៊ែរពី 0 ទៅ 500 mm NaCl ក្នុង 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 សម្រាប់ 25 OK ។បន្ទាប់ពីការផ្លាស់ប្តូរ chromatography អ៊ីយ៉ុង SPACA6 ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំទៅ 1 ml និងត្រូវបានដកចេញដោយឯកឯងពីជួរឈរ ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ដែលមានលំនឹងជាមួយសតិបណ្ដោះអាសន្ន B. យោងតាមក្រូម៉ាតូក្រាម អាង និងប្រភាគប្រមូលផ្តុំដែលមាន SPACA6 ។ភាពបរិសុទ្ធត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ Coomassie-stained electrophoresis នៅលើ 16% SDS-polyacrylamide gel ។កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគណនាដោយការស្រូបនៅកម្រិត 280 nm ដោយប្រើច្បាប់ Beer-Lambert និងមេគុណការផុតពូជតាមទ្រឹស្តី។
បន្សុត SPACA6 ត្រូវបានលាងជម្រះពេញមួយយប់ប្រឆាំងនឹង 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 និង 150 mM NaF ហើយត្រូវបានពនឺទៅ 0.16 mg/mL មុនពេលវិភាគដោយ CD spectroscopy ។ការស្កេនវិសាលគមនៃស៊ីឌីដែលមានរលកពន្លឺពី 185 ដល់ 260 nm ត្រូវបានប្រមូលនៅលើ Jasco J-1500 spectropolarimeter ដោយប្រើ quartz cuvettes ដែលមានប្រវែងផ្លូវអុបទិក 1 មីលីម៉ែត្រ (Helma) នៅ 25 ° C ក្នុងអត្រា 50 nm/min ។វិសាលគមស៊ីឌីត្រូវបានកែតំរូវតាមមូលដ្ឋាន ជាមធ្យមជាង 10 ការទិញយក ហើយបំប្លែងទៅជាអេលីបទិកសំណល់ (θMRE) ក្នុងដឺក្រេ cm2/dmol៖
ដែល MW គឺជាទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃគំរូនីមួយៗនៅក្នុង Da;N គឺជាចំនួនអាស៊ីតអាមីណូ;θ ជារាងពងក្រពើគិតជាមីលីដឺក្រេ;d ត្រូវគ្នាទៅនឹងប្រវែងនៃផ្លូវអុបទិកគិតជាសង់ទីម៉ែត្រ;កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនក្នុងឯកតា។