310 10 * 1mm សមាសធាតុគីមីបំពង់ដែកអ៊ីណុក , ដែន N-terminal នៃ spidroin បង្កើតជា hydrogels ដោយផ្អែកលើ amyloid fibrils និងផ្តល់នូវវេទិកាសម្រាប់ការ immobilization ប្រូតេអ៊ីន។

សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
គ្រាប់រំកិលបង្ហាញអត្ថបទបីក្នុងមួយស្លាយ។ប្រើប៊ូតុងខាងក្រោយ និងបន្ទាប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយ ឬប៊ូតុងឧបករណ៍បញ្ជាស្លាយនៅចុងបញ្ចប់ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយនីមួយៗ។

ការបញ្ជាក់

310 10 * 1mm អ្នកផ្គត់ផ្គង់បំពង់ដែកអ៊ីណុក

សមាសធាតុ​គីមី

លក្ខណៈសម្បត្តិមេកានិច

ប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាងដែលផ្សំឡើងវិញ (ប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាង) មានកម្មវិធីសក្តានុពលជាច្រើនក្នុងការអភិវឌ្ឍសម្ភារៈជីវសាស្ត្រថ្មី ប៉ុន្តែធម្មជាតិចម្រុះ និងការប្រមូលផ្តុំរបស់ពួកគេធ្វើឱ្យពួកគេពិបាកក្នុងការទទួលបាន និងងាយស្រួលប្រើ។នៅទីនេះយើងរាយការណ៍ថាប្រូតេអ៊ីន spidroin ខ្នាតតូចដែលផ្សំឡើងវិញ ហើយសំខាន់ ដែន N-terminal (NT) ខ្លួនវាបង្កើតបានជាអ៊ីដ្រូហ្គេលដែលទ្រទ្រង់ខ្លួនឯង និងតម្លាភាពយ៉ាងឆាប់រហ័សនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេ។ប្រូតេអ៊ីន fusion ដែលមាន NT និងប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង ឬ purine nucleoside phosphorylase បង្កើតបានជាប្រូតេអ៊ីន fusion ដែលមានមុខងារពេញលេញ។អ៊ីដ្រូហ្គេល។លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ប្រូតេអ៊ីន NT និង fusion ផ្សំឡើងវិញផ្តល់នូវទិន្នផលកន្សោមខ្ពស់ និងផ្តល់អ៊ីដ្រូហ្គេលជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិដ៏គួរឱ្យទាក់ទាញដូចជាតម្លាភាព gelation ដោយមិនមានការភ្ជាប់គ្នា និង immobilization ដោយផ្ទាល់នៃប្រូតេអ៊ីនសកម្មនៅដង់ស៊ីតេខ្ពស់។
សត្វពីងពាងមានក្រពេញសូត្រចំនួនប្រាំពីរផ្សេងគ្នា ដែលនីមួយៗបង្កើតប្រភេទសូត្រជាក់លាក់មួយ។ប្រភេទសូត្រទាំងប្រាំពីរត្រូវបានផ្សំឡើងដោយប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាង (ពីងពាង) ប្រហែល 6000 សំណល់វែង និងមានតំបន់ធ្វើឡើងវិញកណ្តាលដ៏ធំមួយដែលហ៊ុំព័ទ្ធដោយដែនស្វ៊ែរ N- និង C-terminal (NT និង CT)1,2 ។ប្រភេទសូត្រដែលត្រូវបានសិក្សាយ៉ាងទូលំទូលាយបំផុតគឺ អំពូឡាបឋម ត្រូវបានផលិតដោយក្រពេញអំពែរបឋម។នៅក្នុងក្រពេញនេះ ស្រទាប់កោសិកានៃកោសិកា epithelial សំយោគប្រូតេអ៊ីន Spidroin និងសម្ងាត់ពួកវាទៅក្នុង lumen នៃក្រពេញ ដែលពួកវាមានវត្តមានក្នុងទម្រង់រលាយ (សារធាតុញៀន) នៅកំហាប់ខ្ពស់ខ្លាំង (30-50% w/v)3,4 ។ការរៀបចំ និងការអនុលោមតាមប្រូតេអ៊ីន ampullar spidroin សំខាន់ៗនៅក្នុងក្រពេញត្រូវបានពិភាក្សា ប៉ុន្តែភស្តុតាងពិសោធន៍ភាគច្រើនបង្ហាញពីវត្តមាននៃការអនុលោមតាម helical និង/ឬចៃដន្យ និងរចនាសម្ព័ន្ធ micellar ឬ lamellar 5,6,7,8,9,10។ខណៈពេលដែលដែនច្រំដែលគ្រប់គ្រងលក្ខណៈសម្បត្តិមេកានិកនៃសរសៃសូត្រ បង្កើតបានជា β-sheet nanocrystals និងរចនាសម្ព័ន្ធអាម៉ូហ្វ 11,12,13,14,15 ដែនបញ្ចប់គ្រប់គ្រងសរសៃសូត្រក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរលក្ខខណ្ឌនៅតាមបណ្តោយក្រពេញសូត្រ 16,17,18។តាមរយៈការគ្រប់គ្រងការបង្កើតសូត្រ 19. Terminal domains ត្រូវបានរក្សាទុកតាមបែបវិវឌ្ឍ ហើយមុខងាររបស់វាអាចជារឿងធម្មតាចំពោះប្រូតេអ៊ីន spidroin ទាំងអស់ 2,20,21។ក្នុងអំឡុងពេលឆ្លងកាត់ក្រពេញ pH នៃ spidroin ថយចុះពីប្រហែល 7.6 ទៅ < 5.716 ហើយកើនឡើងជាមួយនឹងការកាត់ និងលាតសន្ធឹងដែលសម្របសម្រួលដោយចលនាតាមរយៈបំពង់តូចចង្អៀតបន្តិចម្តងៗ។នៅក្នុងដំណោះស្រាយ CT គឺជា α-helical constitutive parallel dimer17 ប៉ុន្តែដើម្បីឆ្លើយតបទៅនឹង pH និងកម្លាំងកាត់ទាប CT លាតត្រដាង និងប្តូរ β-layers16, 17 ដែលអាចបង្កឱ្យមានស្រទាប់ β-layers នៅក្នុងតំបន់ច្រំដែលនៃការបម្លែង 16 ។ NT គឺ monomeric នៅក្រោម លក្ខខណ្ឌដែលឆ្លុះបញ្ចាំងពីលក្ខខណ្ឌនៅក្នុង lumen នៃក្រពេញនិងសម្របសម្រួលការរលាយនៃ spidroin ប៉ុន្តែនៅការថយចុះ pH ប្រូតុងនៃខ្សែសង្វាក់ចំហៀងអាស៊ីត carboxylic មួយចំនួននាំឱ្យមានការថយចុះនៃ NT ជាមួយនឹង pKa ប្រហែល 6.5 ដោយហេតុនេះធ្វើឱ្យ NT ស្ថេរភាពនិងជួសជុល spidroin ធំ។ បរិមាណ។បណ្តាញ 16,18 ។ដូច្នេះ NT ដើរតួយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការបង្កើត filament ដោយផ្លាស់ប្តូរពី monomer នៅក្នុង coating ទៅ dimer នៅក្នុង fiber 23,24,25។NT នៅតែអាចរលាយបានខ្ពស់ និងមានលក្ខណៈទ្រុឌទ្រោមក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងអស់ដែលបានសិក្សារហូតដល់ថ្ងៃទី 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 ដែលជំរុញឱ្យមានការវិវឌ្ឍន៍របស់វាជាស្លាកបង្កើនភាពរលាយសម្រាប់ការផលិតប្រូតេអ៊ីនតំណពូជ។
ប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាងខ្នាតតូចដែលផ្សំឡើងវិញដែលមាន NT មួយ តំបន់ធ្វើឡើងវិញខ្លីមួយ CT មួយ និងស្លាក His6 (His-NT2RepCT) សម្រាប់ការបន្សុត គឺអាចរលាយបាននៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្នក្នុងទឹក ដូចប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាងដើម និងធ្វើត្រាប់តាមលក្ខណៈសំខាន់ៗពីងពាងសូត្រ។ .គ្របដណ្តប់ 25.31 ។His-NT2RepCT អាចត្រូវបានបង្វិលទៅជាសរសៃបន្តគ្នាដោយប្រើម៉ាស៊ីន biomimetic ដែលថ្នាំកូតរលាយ pH 8 ត្រូវបានបញ្ចោញចូលទៅក្នុងទឹក pH 525,32,33,34,35 ។ការ fermentation bioreactor នៃ E. coli បង្ហាញ His-NT2RepCT និងក្រោយការព្យាបាលជាបន្តបន្ទាប់បានលទ្ធផល > 14 g/L ទិន្នផលបន្ទាប់ពីការបន្សុត។ទិន្នផលខ្ពស់ ភាពរលាយខ្ពស់ និងការឆ្លើយតបគ្រប់គ្រាន់នៃ His-NT2RepCT ទៅនឹងលក្ខខណ្ឌអាសុីត គឺត្រូវបានសន្មតថាជា NT23, 25, 34។
នៅទីនេះយើងរាយការណ៍ពីការបង្កើតយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃអ៊ីដ្រូហ្គេលថ្លាពីប្រូតេអ៊ីន spidroin ផ្សំឡើងវិញ រួមទាំង NT តែម្នាក់ឯង ដោយការភ្ញាស់ដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីននៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេ។ដោយប្រើ thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier បំប្លែង spectroscopy អ៊ីនហ្វ្រារ៉េដ (FTIR), spectroscopy ម៉ាញេទិកនុយក្លេអ៊ែរ (NMR) និងបញ្ជូនមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុង (TEM) យើងបានរកឃើញថាប្រូតេអ៊ីន NT និងមីក្រូពីងពាងឆ្លងកាត់ការបំប្លែងរចនាសម្ព័ន្ធទៅជាសន្លឹកβ និងសរសៃអំបោះដូចអាមីឡូអ៊ីត។ នៅពេលដែលជែលត្រូវបានបង្កើតឡើង។លើសពីនេះ ប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នានៃ NT និងប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង (GFP) ឬ purine nucleoside phosphorylase (PNP) បង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្គេលជាមួយនឹងបំណែកលាយបញ្ចូលគ្នាដែលមានមុខងារពេញលេញ។ការបញ្ចេញមតិឆ្លងកាត់ខ្ពស់នៅក្នុងម៉ាស៊ីន heterologous រួមជាមួយនឹងការបង្កើត hydrogels យ៉ាងឆាប់រហ័សនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌសរីរវិទ្យា បើកលទ្ធភាពនៃការផលិត hydrogels ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពជាមួយនឹងមុខងារវិស្វកម្ម។
មិនដូចប្រូតេអ៊ីន spidroin recombinant36 ដែលបានរាយការណ៍ភាគច្រើននោះទេ His-NT2RepCT មានស្ថេរភាពនៅក្នុងបណ្តុំ Tris-HCl នៅ pH 8 ហើយអាចប្រមូលផ្តុំរហូតដល់ 500 mg/mL ដោយគ្មានទឹកភ្លៀង 25 ។ដូច្នេះហើយ យើងមានការភ្ញាក់ផ្អើលដែលបានរកឃើញថា ប្រូតេអ៊ីននេះបង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្គេលដែលជួយខ្លួនឯងបានយ៉ាងច្បាស់លាស់ដោយអុបទិក នៅពេលភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C (រូបភាព 1b-d)។ការសិក្សាបន្ថែមបានបង្ហាញថា His-NT2RepCT gelation បានកើតឡើងលើជួរដ៏ធំទូលាយនៃកំហាប់ប្រូតេអ៊ីន (10–300 mg/mL) ហើយថាកំហាប់នេះត្រូវបានទាក់ទងច្រាសជាមួយនឹងពេលវេលា gelation (រូបភាព 1c និងបន្ថែម រូបទី 1)។ដើម្បីរកមើលថាតើផ្នែកណាមួយនៃ His-NT2RepCT សម្រុះសម្រួលការបង្កើតអ៊ីដ្រូហ្គេល បន្ទាប់មកយើងបានពិនិត្យដែននីមួយៗដោយឡែកៗពីគ្នា និងក្នុងបន្សំផ្សេងៗ ដោយប្រើការវិភាគបញ្ច្រាសដប (រូបភាពទី 1a, ខ)។ប្រភាគដែលបានសាកល្បងទាំងអស់នៃ spidroin បង្កើតជាជែលដែលផ្សំឡើងវិញ (នៅកំហាប់ប្រូតេអ៊ីន 300 mg/mL) ក្នុងរយៈពេលតិចជាង 1 ម៉ោង លើកលែងតែ 2Rep ដែល precipitated (រូបភាព 1b) ។នេះបង្ហាញថា NT និង CT តែមួយបញ្ចូលគ្នា ឬជាប់ពាក់ព័ន្ធជាមួយនឹងការធ្វើម្តងទៀត អាចជែលនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយស្លាក His6 មិនប៉ះពាល់ដល់ដំណើរការនេះក្នុងកម្រិតសំខាន់ណាមួយឡើយ។ដោយផ្អែកលើគំនិតទូទៅដែលថា NT គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលអាចរលាយបានខ្ពស់ និងមានស្ថេរភាព ហើយរបាយការណ៍មុននៃ hydrogels ពីងពាងដែលផ្សំឡើងវិញបានសន្មតថាឥទ្ធិពល gelation ទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់ក្នុងតំបន់ដដែលៗ និង/ឬ CTs, NT ខ្លួនវាអាចធ្វើបាន។ការរកឃើញ gelation គឺមិននឹកស្មានដល់។តារាងបន្ថែម 1) 37, 38, 39. គួរកត់សម្គាល់ថា NT រលាយបាត់ក្នុងរយៈពេល 10 នាទីនៅកំហាប់≥ 300 mg/mL (រូបភាព 1c)។ការពិសោធបញ្ច្រាសនៃដបជាមួយនឹងការប្រមូលផ្តុំផ្សេងៗនៃ NT បានបង្ហាញថានៅ> 50 mg/mL ដំណោះស្រាយ NT រលាយលឿនជាង His-NT2RepCT នៅកំហាប់ដែលត្រូវគ្នា (w/v, រូបភាពទី 1c) ។
តំណាងគ្រោងការណ៍នៃសំណង់ spidroin ផ្សេងៗដែលបានសិក្សានៅក្នុងការងារនេះ។b ពេលវេលាជែលនៅសីតុណ្ហភាព 37°C សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន spidroin ដែលផ្សំឡើងវិញជាច្រើនប្រភេទ (300 mg/mL) ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយដាក់បញ្ច្រាសដប។CT gel ភ្លាមៗដោយមិនចាំបាច់ incubation (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, ខ្នាត 5 mm)។c ពេលវេលាជែលរបស់ His-NT2RepCT និង NT នៅកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលបានចង្អុលបង្ហាញនៅ 37 ° C ។d រូបថត His-NT2RepCT និង NT hydrogels ដែលមានពីងពាង និងអក្សរ “NT” បោះពុម្ពនៅខាងក្រោមរៀងគ្នា (ទាំង 200 mg/mL, scale bar 5 mm)។
អ៊ីដ្រូហ្គេលដែលបង្កើតឡើងដោយប្រូតេអ៊ីនស្ពីដ្រូអ៊ីនដែលផ្សំឡើងវិញជាច្រើនមានពណ៌ខុសគ្នាបន្តិចបន្តួច ហើយការសង្កេតដោយភ្នែកទទេបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នានៃតម្លាភាព (រូបភាពទី 1 ខ) ។NT gels មានភាពច្បាស់លាស់ជាពិសេសខណៈពេលដែលជែលផ្សេងទៀតក្លាយទៅជាស្រអាប់។His-NT2RepCT និង NT gels បោះចូលទៅក្នុងបំពង់រាងស៊ីឡាំងអាចត្រូវបានយកចេញពីផ្សិតនៅដដែល (រូបភាព 1 ឃ) ។
ដើម្បីសាកល្បងថាតើជែលថ្នាំកូតសូត្រពីងពាងធម្មជាតិនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌឥឡូវនេះបានរកឃើញថាធ្វើឱ្យមានជាតិប្រូតេអ៊ីនពីងពាងដែលផ្សំឡើងវិញឬអត់នោះ ថ្នាំកូតត្រូវបានប្រមូលពីក្រពេញ ampulla ដ៏ធំនៃពីងពាងស្ពានស៊ុយអែត (Larinioides sclopetarius)។ថ្នាំកូតត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 20 mM Tris-HCl នៅកម្រិត 50 mg/mL (ផ្អែកលើទម្ងន់ស្ងួតដែលបានវាស់វែង) ប៉ុន្តែគ្មានការកត់សុីណាមួយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញក្នុងអំឡុងពេល incubation 21 ថ្ងៃនៅសីតុណ្ហភាព 37 °C (រូបភាពបន្ថែម 2a)។
ដើម្បីកំណត់បរិមាណជែលទាំងនេះ ការវាស់វែង rheological អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាដំណើរការ gelation និងកំណត់លក្ខណៈសម្បត្តិមេកានិចទាំងមូល។ជាពិសេសការត្រួតពិនិត្យម៉ូឌុលផ្ទុក (ភាពបត់បែន) នៅសីតុណ្ហភាពកើនឡើងអាចផ្តល់ព័ត៌មានអំពីសីតុណ្ហភាព gelling ក៏ដូចជាលក្ខណៈសម្បត្តិ viscoelastic នៃថ្នាំកូត។ការពិសោធន៍ការកើនឡើងសីតុណ្ហភាព (ដោយប្រើ 1°C/min នៅសីតុណ្ហភាព 25-45°C ដោយផ្អែកលើការសិក្សាពីមុនដោយប្រើដំណោះស្រាយស្តុកសូត្រធម្មជាតិ) 40,41 បានបង្ហាញថាម៉ូឌុលផ្ទុកនៃដំណោះស្រាយ His-NT2RepCT និង NT បានកើនឡើងជាមួយនឹងការកើនឡើងសីតុណ្ហភាព។ត្រូវបានកើនឡើង (រូបភាពទី 2 និងរូបភាពបន្ថែម 3) ។គួរកត់សម្គាល់ថាម៉ូឌុល NT បានចាប់ផ្តើមលូតលាស់នៅសីតុណ្ហភាពទាបជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹង His-NT2RepCT ដែលស្របជាមួយនឹងពេលវេលាជែលលឿនជាងមុនដែលបានសង្កេតឃើញនៅពេលដែល NT ត្រូវបាន incubated ដោយផ្ទាល់ជាមួយ His-NT2RepCT នៅ 37 ° C (រូបភាពទី 1) ។បន្ទាប់ពីការធ្លាក់ចុះនៃសីតុណ្ហភាពជាបន្តបន្ទាប់ ម៉ូឌុលផ្ទុកមិនត្រលប់ទៅតម្លៃទាបវិញទេ ហើយនៅតែស្ថិតនៅខាងលើម៉ូឌុលការបាត់បង់ (សូមមើលរូបបន្ថែម។ 3) ដែលបង្ហាញពី gelation ស្ថេរភាពដែលមិនអាចត្រឡប់វិញដោយកម្ដៅ។បន្ទាប់ពី gelation ម៉ូឌុលយឺតចុងក្រោយមានចាប់ពី 15 ទៅ 330 kPa សម្រាប់ His-NT2RepCT hydrogels នៅកំហាប់ 100–500 mg/mL ហើយម៉ូឌុលយឺតចុងក្រោយសម្រាប់ NT hydrogels (100–500 mg/mL) មានចាប់ពី 2 ទៅ 1400 kPa (រូបភាពទី 2 និងទិន្នន័យផ្លូវជម្រាលពេញលេញ) សូមមើលរូបភាពបន្ថែម 3) ។
ការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពអំឡុងពេលវាស់ His-NT2RepCT (300 mg/mL) និង b NT (300 mg/mL) ជាមួយនឹងការញ័រ។ព្រួញបង្ហាញពីនិន្នាការសីតុណ្ហភាព ហើយការដាក់ស្រមោលស្រាលជាងមុននៃទិន្នន័យម៉ូឌុលផ្ទុកពណ៌នាការធ្វើតេស្តនៅតម្លៃកម្លាំងបង្វិលជុំទាបសម្រាប់ឧបករណ៍ជាងការបញ្ជាក់ដោយក្រុមហ៊ុនផលិត ដែលជាមូលហេតុនៃការកើនឡើងសំឡេង។c ការប្រមូលផ្តុំម៉ូឌុលចុងនៃ His-NT2RepCT និង NT បន្ទាប់ពីសីតុណ្ហភាពកើនឡើង (100, 300, និង 500 mg/mL)។ការអានម៉ូឌុលទាំងអស់ត្រូវបានគេយកនៅប្រេកង់ 0.1 Hz ។
ជាវិធីសាស្រ្តដ៏មានសក្តានុពលមួយសម្រាប់ការស៊ើបអង្កេតការផ្លាស់ប្តូរអនុលោមភាពដែលទាក់ទងនឹងការ gelation យើងបានកត់ត្រា FTIR spectra នៃ His-NT2RepCT និង NT មុនពេល និងក្រោយពេល gelation នៅសីតុណ្ហភាព 37°C (រូបភាព 3a,b)។ដូចដែលបានរំពឹងទុក វិសាលគមនៃដំណោះស្រាយ His-NT2RepCT និង NT ត្រូវគ្នាទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ α-helix/random coil ជាមួយនឹងក្រុមតន្រ្តីបញ្ចេញសម្លេងនៅ 1645 សង់ទីម៉ែត្រ-1 ។សម្រាប់ hydrogels ទាំងពីរ gelation បណ្តាលឱ្យមានការបង្កើតដៃពីរនៅកណ្តាល I band នៅប្រហែល 1617 cm-1 និង 1695 cm-1 (Fig ។ 3a, b) ដែលបង្ហាញពីការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធសន្លឹកប្រឆាំងប៉ារ៉ាឡែល។ការផ្លាស់ប្តូរទាំងនេះក៏អាចត្រូវបានគេមើលឃើញយ៉ាងច្បាស់នៅក្នុងនិស្សន្ទវត្ថុទីពីរ និងភាពខុសគ្នានៃ gelation spectra (រូបភាពបន្ថែម 4b)។ក្រុមតន្រ្តីទាំងពីរនៃស្រទាប់ NT β-layer ត្រូវបានគេដឹងច្បាស់ជាង His-NT2RepCT ដែលបង្ហាញថាមាតិកាសរុបនៃស្រទាប់β-layer នៅក្នុង NT hydrogel គឺខ្ពស់ជាង hydrogel NT2RepCT ។
វិសាលគមស្រូប FTIR នៃ His-NT2RepCT និង b NT (ទាំង 500 mg/mL) មុន (ដំណោះស្រាយ) និងក្រោយ (gel) incubation នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។c រូបភាព TEM នៃជែល NT2RepCT 50 mg/ml ដែលត្រូវបានផ្អាក និង d NT ។របារមាត្រដ្ឋាន 200 nm ។e អង្កត់ផ្ចិត Fiber នៃ His-NT2RepCT និង NT hydrogels ។n = 100 fibrils វាស់, p < 0.0001 ។របារកំហុសបង្ហាញគម្លាតស្តង់ដារ។ចំណុចកណ្តាលនៃរបារកំហុសគឺជាមធ្យម។ការធ្វើតេស្ត t ដែលមិនផ្គូផ្គង (ពីរកន្ទុយ) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិ។f ThT fluorescence នៃប្រូតេអ៊ីន spidroin recombinant ជាច្រើន (100 mg/mL) នៅ 37 °C ដោយមិនញ័រ។g NT (100 mg/mL) ពិសោធន៍ inoculation ពី 100 mg/mL NT gel ជាមួយ 0%, 5%, 10%, និង 20% គ្រាប់។
ការវិភាគនៃជែលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន (TEM) បានបង្ហាញថាអ៊ីដ្រូជែលមានសរសៃអំបោះដូចអាមីឡូអ៊ីត (រូបភាព 3c, 3d) ។សរសៃដែលបង្កើតដោយ NT ត្រូវបានពន្លូត (អង្កត់ផ្ចិត 5-12 nm) និងមិនមានផ្នែកទេ ខណៈពេលដែលសរសៃ His-NT2RepCT មានប្រវែងខ្លីជាង និងមានអង្កត់ផ្ចិតធំជាង (7-16 nm) (រូបភាព 3e)។លទ្ធផលទាំងនេះបានអនុញ្ញាតឱ្យយើងធ្វើតាម kinetics នៃ fibrosis ដោយប្រើ thioflavin T (ThT) assay ។ចំពោះប្រូតេអ៊ីន spidroin ដែលត្រូវបានផ្សំឡើងវិញទាំងអស់ សញ្ញា fluorescent បានកើនឡើង នៅពេលដែលគំរូត្រូវបាន incubated នៅ 37 °C (រូបភាព 3f, បន្ថែម រូបភព 5a) ។ស្របជាមួយនឹងការរកឃើញនេះ ការពិនិត្យមីក្រូទស្សន៍នៃ NT និង His-NT2RepCT នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃការបញ្ចេញទឹករំអិលបានបង្ហាញពីការកើនឡើងឯកសណ្ឋាននៃ fluorescence ThT ដោយគ្មានការប្រមូលផ្តុំក្នុងតំបន់គួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការប្រមូលផ្តុំ ThT-positive (រូបភាពបន្ថែម 5b,c) ។ការបង្កើតសរសៃ ThT-positive មិនត្រូវបានអមដោយការកើនឡើងនៃ NT និងភាពច្របូកច្របល់របស់ His-NTCT (រូបភាពបន្ថែម 5d) ដែលមានន័យថាបណ្តាញនៃសរសៃនៅក្នុងជែលអាចបង្កើតបានដោយមិនប៉ះពាល់ដល់ភាពច្បាស់លាស់របស់ជែល។ការបណ្ដុះដោយបន្ថែមបរិមាណតិចតួចនៃសរសៃដែលបង្កើតមុនអាចពន្លឿនការបង្កើតសរសៃអាមីឡូអ៊ីតមួយចំនួន 42,43,44 ប៉ុន្តែបន្ថែម 5%, 10% ឬ 20% (w/w) NT ទៅក្នុងដំណោះស្រាយនៃ NT hydrocoagulants ។ប្រសិទ្ធភាពគ្រាប់ពូជ (រូបភាព 3 ក្រាម) ។ប្រហែលជានេះគឺដោយសារតែការពិតដែលថា fibrils នៅក្នុង hydrogel ត្រូវបានជួសជុលហើយមិនអាចប្រើជាគ្រាប់ពូជបានទេ។
អាកប្បកិរិយាដែលមិននឹកស្មានដល់នៃប្រូតេអ៊ីន spidroin ផ្សំឡើងវិញនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់បានជំរុញឱ្យមានការសិក្សាស្រាវជ្រាវ spectroscopy ម៉ាញេទិកនុយក្លេអ៊ែរ (NMR) បន្ថែមទៀតដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់ដែលទាក់ទងនឹងការបង្កើតជែល។វិសាលគម NMR នៃដំណោះស្រាយ His-NT2RepCT ដែលបានកត់ត្រាតាមពេលវេលានៅ 37 ° C បានបង្ហាញថា CT នៅតែត្រូវបានបត់ដោយផ្នែក ចំណែក NT និង 2Rep signals បានបាត់ (រូបភាព 4a) ដែលបង្ហាញថាវាជាចម្បង NT និង 2Rep ដែលគ្រប់គ្រងដោយផ្នែកនៃការបង្កើត His- អ៊ីដ្រូជែល NT2RepCT ។សញ្ញា CT ក៏ត្រូវបានកាត់បន្ថយទៅ 20% នៃអាំងតង់ស៊ីតេដើមរបស់វា ដែលបង្ហាញថា CT ក៏ត្រូវបានជួសជុល និងបញ្ចូលទៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធអ៊ីដ្រូជែលផងដែរ។សម្រាប់ផ្នែកតូចជាងនៃ CT ដែលមានលក្ខណៈចល័តដូចនៅក្នុងគំរូ preincubated ហើយដូច្នេះត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយដំណោះស្រាយ NMR នោះ spectra ខ្វះសញ្ញាសម្រាប់សំណល់ដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធ 10 ដំបូង ដែលអាចបណ្តាលមកពីការពិបាក immobilization នៃផ្នែកភ្ជាប់របស់ His-NT2Rep ។វិសាលគម NMR នៃ -state នៃ hydrogels -NT2RepCT បានបង្ហាញវត្តមានលេចធ្លោនៃ α-helices និង β-layers ហើយចំពោះវិសាលភាពតិចជាង ការអនុលោមតាម coil ចៃដន្យ (រូបភាព 4b) ។ការវិភាគការផ្លាស់ប្តូរគីមីនៃសំណល់ methionine ដែលមានវត្តមានតែនៅក្នុង NT បានបង្ហាញថាដែននេះត្រូវបានបំប្លែងទៅជារចនាសម្ព័ន្ធសន្លឹកβ។វិសាលគមអាស្រ័យលើពេលវេលានៃ NT នៅក្នុងដំណោះស្រាយបានបង្ហាញពីការថយចុះឯកសណ្ឋាននៃអាំងតង់ស៊ីតេសញ្ញា (រូបភាព 4c) ហើយ NMR រដ្ឋរឹងនៃ NT hydrogels បានបង្ហាញថាសំណល់ NT ភាគច្រើនត្រូវបានបំលែងទៅជារចនាសម្ព័ន្ធ β-សន្លឹក (រូបភាព 4 ឃ) ។ការអនុលោមតាម 2Rep មិនអាចកំណត់ដោយឡែកពីគ្នាបានទេ ដោយសារទំនោរក្នុងការប្រមូលផ្តុំ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វិសាលគម NMR រដ្ឋរឹងនៃ NTCT និង His-NT2RepCT hydrogels មើលទៅស្រដៀងគ្នាខ្លាំងណាស់ (រូបភាពទី 4b; រូបភពបន្ថែម 6b) ដែលបង្ហាញថា 2Rep បានរួមចំណែកតិចតួចដល់ផ្នែករចនាសម្ព័ន្ធនៃអ៊ីដ្រូជែល His-NT2RepCT ។សម្រាប់ CT hydrogels α-helices សន្លឹក β- និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ helical ចៃដន្យត្រូវបានរកឃើញថាមាន (រូបភាពបន្ថែម 6d) ។នេះបង្ហាញថាផ្នែកខ្លះនៃ CT នៅតែជា α-helices ខណៈពេលដែលផ្នែកខ្លះទៀតក្លាយជាសន្លឹកβ។ដូច្នេះ លទ្ធផលនៃ NMR spectroscopy បង្ហាញថា NT មានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបង្កើតអ៊ីដ្រូជែល ហើយក៏បំប្លែងទៅជាការអនុលោមតាមសន្លឹក β លើការលាយបញ្ចូលគ្នាជាមួយ 2Rep និង CT ។ស្របនឹងបញ្ហានេះ ថ្មីៗនេះ យើងបានរកឃើញថា ខ្សែរ៉ូតអាមីឡូអ៊ីត ទំនងជាបង្កើតបាននៅក្នុង helices ទាំងប្រាំនៃដែន NT ហើយក្បួនដោះស្រាយ Waltz បានព្យាករណ៍ពីតំបន់ amyloidogenic នៅក្នុង helix 1 (រូបភាព 4e) ។
វិសាលគម 2D នៃដំណោះស្រាយ 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT មុន (ពណ៌ខៀវ) និង 19 ម៉ោងបន្ទាប់ពី incubation (ក្រហម) នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។កំពូលឈើឆ្កាងបុគ្គលនៅក្នុងវិសាលគមក្រហម និង F24, G136, polyA ក្នុងវិសាលគមពណ៌ខៀវត្រូវបានតំណាងដោយនិមិត្តសញ្ញាអាស៊ីតអាមីណូអក្សរតែមួយ និងលេខសំណល់។insets បង្ហាញពីភាពអាស្រ័យនៃអាំងតង់ស៊ីតេសញ្ញាទាន់ពេលវេលាសម្រាប់សំណល់ដែលបានជ្រើសរើសពីដែន NT, 2Rep និង CT ។ខ) វិសាលគមនៃប្រេកង់វិទ្យុរដ្ឋរឹង (RFDR) នៃអ៊ីដ្រូហ្គេល His-NT2RepCT ។ការជាប់ទាក់ទងគ្នានៃសំណល់ Cα/Cβ ដែលត្រូវបានអង្កេតនៅក្នុង RFDR spectra ត្រូវបានកំណត់ដោយការប្រៀបធៀបជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរគីមី peptide គំរូ និងតម្លៃដែលទទួលបានពីស្ថិតិ82,83 និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំរបស់ពួកគេ។SSB - បង្វិលចំហៀង។c វិសាលគមមួយវិមាត្រនៃដំណោះស្រាយ 15N-HSQC 10 mg/mL NT អំឡុងពេល incubation នៅសីតុណ្ហភាព 37 °C រយៈពេល 36 ម៉ោង។ធាតុបញ្ចូលបង្ហាញពីអាំងតង់ស៊ីតេបរិមាណធៀបនឹងពេលវេលា។d វិសាលគម RFDR រដ្ឋរឹងនៃ NT hydrogels ។ការជាប់ទាក់ទងគ្នានៃសំណល់ Cα/Cβ និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំរបស់ពួកគេដែលបានសង្កេតនៅក្នុងវិសាលគម RFDR ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញ។e ផ្អែកលើទម្រង់ NT45.79 fibrillation propensity ពីមូលដ្ឋានទិន្នន័យ Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ។ថាមពល Rosetta នៃបង្អួចផ្លាស់ប្តូរផ្លេកបន្ទោរនៃ hexapeptide ត្រូវបានបង្ហាញជា kcal/mol ។របារក្រហមបង្ហាញពី hexapeptides ដែលមានទំនោរ fibrosis ខ្ពស់ (ថាមពល Rosetta ខាងក្រោម -23 kcal / mol; ខាងក្រោមបន្ទាត់ចំនុច) ។របារពណ៌បៃតងបង្ហាញពីបំណែកដែលមានថាមពល Rosetta លើសពីកម្រិតកំណត់ ដូច្នេះហើយទំនងជាមិនសូវបង្កើតជាខ្សែរ៉ូតស្តេរ៉ូអ៊ីតទេ។បំណែកដែលមានប្រូលីនត្រូវបានដកចេញពីការវិភាគ (ដោយគ្មានជួរឈរ)។ការេបង្ហាញពីតំបន់នៃ amyloidosis ដែលព្យាករណ៍ដោយ Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org) ។លំដាប់នៃសំណល់អាស៊ីតអាមីណូនៃ NT គឺនៅផ្នែកខាងលើ ហើយប្រភេទសំណល់ដែលមាននៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ β (កំណត់ដោយ spectroscopy NMR រដ្ឋរឹង) ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ក្រហម។ទីតាំងនៃ NT α-helices ទាំងប្រាំត្រូវបានកំណត់ជា (H1-H5)28 ។
នៅ pH < 6.5, HT ថយចុះ ដោយមានភាពធន់នឹងកំដៅ ឬ អ៊ុយរ៉េដែលបង្កឡើងដោយ denaturation18 ។ដើម្បីបញ្ជាក់ពីរបៀបដែល NT dimerization និងស្ថេរភាពប៉ះពាល់ដល់ gelation ដំណោះស្រាយដែលមាន 100 mg/ml NT ត្រូវបានគ្រប់គ្រងនៅ pH 8, 7, និង 6 ដោយប្រើតេស្តបញ្ច្រាស vial ។សំណាក NT incubated នៅ pH 8 និង 7 gelled បន្ទាប់ពី 30 នាទីនៅ 37 ° C ប៉ុន្តែ pH 8 gel នៅតែច្បាស់ខណៈពេលដែល pH 7 gel បង្ហាញពីទឹកភ្លៀងដែលអាចមើលឃើញ (រូបភាព 5a) ។ផ្ទុយទៅវិញ ដំណោះស្រាយដែលមាន HT នៅ pH 6 មិនបង្កើតជាជែលទេ ហើយទឹកភ្លៀងដ៏ធំអាចត្រូវបានគេមើលឃើញបន្ទាប់ពី 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេ។នេះបង្ហាញថា dimers ខ្លួនគេ និង/ឬស្ថេរភាពខ្ពស់របស់ពួកគេបើប្រៀបធៀបទៅនឹង monomers ការពារការ gelation ។ការបង្កើត precipitate សម្រាប់ NT នៅ pH 7 និង 6 មិនត្រូវបានគេរំពឹងទុកទេព្រោះវាត្រូវបានគេរាយការណ៍ថា NT គឺរលាយក្នុង 200 mg/ml27 ងាយរលាយឡើងវិញបន្ទាប់ពីការប្រែពណ៌ហើយក៏រក្សា α-helix នៅតម្លៃទាបនៃ pH 18. ការពន្យល់ដែលទំនងសម្រាប់ភាពខុសគ្នាទាំងនេះគឺថា ការពិសោធន៍ដែលបានរាយការណ៍ពីមុនត្រូវបានធ្វើឡើងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ឬខាងក្រោម ឬនៅកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនទាប 16,18,19។
ការធ្វើតេស្តបញ្ច្រាស NT vial (100 mg/mL) នៅ pH 8, 7, 6 និង 154 mM NaCl (pH 8) បន្ទាប់ពី incubation នៅ 37°C ។b NT CD spectra ដោយមាន និងគ្មាន 154 mM NaF និង 154 mM NaCl រៀងគ្នា។Molar ellipticity នៅ 222 nm ត្រូវបានបំប្លែងទៅជាសមាមាត្រនៃផ្នត់ធម្មជាតិ។c ការវិភាគបញ្ច្រាស NT (100 mg/mL) NT* (37 °C និង 60 °C), NTA72R (37 °C) និង His-NT-L6 (37 °C និង 60 °C) ។d វិសាលគមស៊ីឌីនៃ NT mutants NT*, NTA72R, និង His-NT-L6 ។Molar ellipticity នៅ 222 nm ត្រូវបានបំប្លែងទៅជាសមាមាត្រនៃផ្នត់ធម្មជាតិ។e ការធ្វើតេស្តបញ្ច្រាសនៃ NTFlSp, NTMiSp និងកាត់បន្ថយ NTMiSp (100 mg/mL)។របារមាត្រដ្ឋាន 5 ម។f វិសាលគមស៊ីឌីនៃ NT, NTFlSp, NTMiSp និងកាត់បន្ថយ NTMiSp ។Molar ellipticity នៅ 222 nm ត្រូវបានបំប្លែងទៅជាសមាមាត្រនៃផ្នត់ធម្មជាតិ។Full NT spectra នៅ 25°C និង 95°C ត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពបន្ថែម 8។
កំហាប់អំបិលខាងសរីរវិទ្យាកំណត់អន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិចរវាងផ្នែករង NT និងការថយចុះនៃការផ្ទេរ NT ទៅ pH18 ទាប។យើងបានរកឃើញថាវត្តមានរបស់ 154 mM NaCl និង NaF ពិតជាបានរារាំង gelation រៀងគ្នា (រូបភាព 5a, b; រូបភពបន្ថែម 2b) ហើយថាអំបិលទាំងនេះបានបង្កើនស្ថេរភាពកម្ដៅនៃ NT monomers (រូបភាព 5b, រូបភពបន្ថែម 8) ។ .វាក៏ណែនាំផងដែរថាការពង្រឹងស្ថេរភាព ជាជាងការធ្វើឱ្យស្រអាប់ ការពារការបង្កើតជែល។
ដើម្បីស្វែងយល់បន្ថែមអំពីតួនាទីនៃការបែងចែកប្រូតេអ៊ីន និងស្ថេរភាពនៅក្នុង gelation យើងបានប្រើ mutants ពីរគឺ NT* និង NTA72R ដែលនៅតែជា monomeric នៅ pH28.30 ទាប។NT* គឺជាបំរែបំរួលបញ្ច្រាសការគិតថ្លៃពីរដង ដែលការចែកចាយបន្ទុក dipolar ជាក់ស្តែងនៃម៉ូណូមឺរត្រូវបានរុញភ្ជាប់ ដែលការពារភាពស្រអាប់ និងបង្កើនស្ថេរភាពម៉ូណូម័រយ៉ាងខ្លាំង។NTA72R គឺជា dipole ដែលត្រូវបានគិតថ្លៃ ប៉ុន្តែ Arg-substituted Ala មានទីតាំងនៅព្រំដែន dimer ដូច្នេះការផ្លាស់ប្តូររំខានដល់អន្តរកម្មរងដែលត្រូវការសម្រាប់ dimerization ។នៅពេល incubation នៅសីតុណ្ហភាព 37°C NT* មិនបង្កើតជា hydrogel ទេ ខណៈដែល NTA72R បង្កើតជាជែលស្រអាប់សម្រាប់រយៈពេល 15 នាទី (រូបភាព 5c)។ដោយសារទាំង NT* និង NTA72R មិនអាចបន្ថយបាន ប៉ុន្តែមានភាពខុសប្លែកគ្នានៅក្នុងស្ថេរភាពម៉ូណូម័រ (រូបភាពទី 5d) លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញយ៉ាងមុតមាំថាស្ថេរភាពកំដៅខ្ពស់ការពារ NT ពីការសាយភាយ។នេះក៏ត្រូវបានគាំទ្រដោយការពិតដែលថា HT* បង្កើតជាជែលនៅពេលដែលវាមិនស្ថិតស្ថេរនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ (បន្ទាប់ពី 8 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 60 ° C; រូបភព 5c) ។វាត្រូវបានបង្ហាញពីមុនថាមាតិកាខ្ពស់នៃ methionine នៅក្នុង NT ធ្វើឱ្យការបត់ធម្មជាតិរបស់វា ហើយសារធាតុ Met to Leu ចំនួនប្រាំមួយ (ហៅថា His-NT-L6) ធ្វើឱ្យមានស្ថេរភាពយ៉ាងខ្លាំងដល់ម៉ូណូម័រ NT46 ។ដោយផ្អែកលើការសន្មត់ថាភាពបត់បែនតាមលំដាប់គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការបង្កើតជែល NT យើងបានរកឃើញថា សារធាតុបំប្លែងដែលមានស្ថេរភាព His-NT-L6 មិនជែលនៅសីតុណ្ហភាព 37 °C (រូបភាព 5c, ឃ) ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ His-NT-L6 ក៏បានបង្កើតជាជែលនៅពេលភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 60°C រយៈពេល 60 នាទី (រូបភាព 5c)។
សមត្ថភាពរបស់ NT ដើម្បីបំប្លែងទៅជារចនាសម្ព័ន្ធ β-សន្លឹក និងទម្រង់ hydrogels ហាក់ដូចជាអនុវត្តចំពោះដែនមួយចំនួន ប៉ុន្តែមិនមែនទាំងអស់នៃដែន NT នៃ spidroin នោះទេ។NTs ពីប្រភេទសូត្រផ្សេងៗគ្នា និងប្រភេទសត្វពីងពាង Trichonephila clavipes (NTFlSp) បានបង្កើតជាជែល ទោះបីជាមានមាតិកា methionine ទាប និងស្ថេរភាពកម្ដៅខ្ពស់ (រូបភាព 5e, f និងតារាងបន្ថែម 2)។ផ្ទុយទៅវិញ NT ពីប្រូតេអ៊ីន ampullar តូច spidroin ពី Araneus ventricosus (NTMiSp) ដែលមានស្ថេរភាពកម្ដៅទាប និងមាតិកា methionine ខ្ពស់ មិនបានបង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្គេលទេ (តារាងបន្ថែម 2 និងរូបទី 5e, f)។ក្រោយមកទៀតអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងវត្តមាននៃចំណង disulfide intramolecular 29,47 ។ជាប់លាប់ នៅពេលដែលចំណង disulfide នៃ NTMiSp ត្រូវបានកាត់បន្ថយ វាបង្កើតបានជាអ៊ីដ្រូជែល បន្ទាប់ពីភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 10 នាទី (រូបភាព 5e)។នៅក្នុងការសន្និដ្ឋានវាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាភាពបត់បែននៃរចនាសម្ព័ន្ធគឺជាលក្ខណៈសំខាន់មួយប៉ុន្តែមិនមែនជាលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យតែមួយគត់សម្រាប់ការបង្កើតជែលពី NT ។កត្តាមួយទៀតដែលអាចពាក់ព័ន្ធគឺទំនោរក្នុងការបង្កើតដុំសាច់អាមីឡូអ៊ីត ហើយការវិភាគជាមួយមូលដ្ឋានទិន្នន័យខ្សែរ៉ូត និងក្បួនដោះស្រាយ Waltz បានបង្ហាញទំនាក់ទំនងគ្នារវាងសមត្ថភាពក្នុងការបង្កើតជែល និងវត្តមាននៃតំបន់អាមីឡូអ៊ីដហ្សែន ក៏ដូចជាវិសាលភាពនៃតំបន់ដែលបានព្យាករណ៍។ ដើម្បីបង្កើតជាខ្សែរ៉ូត steric ។មានការជាប់ទាក់ទងគ្នា (តារាងបន្ថែមទី 2 និងរូបភាពបន្ថែម 9) ។
សមត្ថភាពរបស់ NT ដើម្បីបង្កើតជាដុំសាច់ និងបង្កើតជាជែលក្រោមលក្ខខណ្ឌអំណោយផលបាននាំឱ្យយើងសន្មត់ថាការលាយ NT ជាមួយបំណែកប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតនៅតែអាចបង្កើតជាជែលជាមួយនឹងមុខងារពេញលេញនៃដៃគូបញ្ចូលគ្នា។ដើម្បីធ្វើតេស្តនេះ យើងបានណែនាំប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង (GFP) និង purine nucleoside phosphorylase (PNP) នៅ C-terminus នៃ NT រៀងគ្នា។លទ្ធផលនៃប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង E. coli ជាមួយនឹងទិន្នផលចុងក្រោយខ្ពស់ណាស់ (150 mg/L និង 256 mg/L shake flask cultures សម្រាប់ His-NT-GFP និង His-NT-PNP រៀងគ្នា) ស្របតាមអ្វីដែលបានបង្ហាញ សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតដែលផ្សំជាមួយ NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) និង His-NT-PNP (100mg/mL) ប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នាបង្កើតជាជែលបន្ទាប់ពី 2 ម៉ោង និង 6.5 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយសំខាន់ ប្រភាគ GFP នៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរ។សង្កេតបន្ទាប់ពី gelation ជាមួយនឹង> 70% នៃអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ដំបូងដែលនៅសល់បន្ទាប់ពីការ gelation (រូបភាព 6a) ។ដើម្បីវាស់សកម្មភាព PNP នៅក្នុងដំណោះស្រាយ និងជែល NT-PNP របស់គាត់ យើងត្រូវពនលាយប្រូតេអ៊ីនជាមួយ NT ពីព្រោះសកម្មភាពអង់ស៊ីមនៃការរៀបចំសុទ្ធគឺនៅក្រៅជួរនៃការរកឃើញនៃការវិភាគនៅកំហាប់ gelling ។ជែលដែលបង្កើតឡើងជាមួយនឹងល្បាយដែលមាន 0.01 mg/mL His-NT-PNP និង 100 mg/mL NT រក្សាបាន 65% នៃសកម្មភាពអង់ស៊ីមដំបូងនៃសំណាក preincubated (រូបភាព 6b) ។ជែលនៅដដែលកំឡុងពេលវាស់ (រូបភាពបន្ថែម 10)។
អាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ដែលទាក់ទងមុន និងក្រោយពេលបញ្ចេញទឹក His-NT-GFP (300 mg/mL) និងដបដាក់បញ្ច្រាសដែលមាន His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) នៅក្រោមពន្លឺដែលអាចមើលឃើញ និងកាំរស្មីយូវី។ពិន្ទុបង្ហាញពីការវាស់វែងបុគ្គល (n = 3) របារកំហុសបង្ហាញគម្លាតស្តង់ដារ។តម្លៃមធ្យមត្រូវបានបង្ហាញនៅកណ្តាលរបារកំហុស។b សកម្មភាព PNP ត្រូវបានទទួលដោយការវិភាគ fluorometric ដោយប្រើដំណោះស្រាយ និងជែលដែលមាន NT (100 mg/ml) និងល្បាយដែលមាន 0.01 mg/ml his-NT-PNP និង 100 mg/ml តៃវ៉ាន់ថ្មី។ប្រអប់បញ្ចូលបង្ហាញដបដាក់បញ្ច្រាសដែលមានអ៊ីដ្រូជែលដែលមាន His-NT-PNP (របារមាត្រដ្ឋាន 5 មីលីម៉ែត្រ) ។
នៅទីនេះ យើងរាយការណ៍ពីការបង្កើតអ៊ីដ្រូហ្គេលពី NT និងប្រូតេអ៊ីន ស្ពីដ្រូអ៊ីន ដែលផ្សំឡើងវិញផ្សេងទៀតដោយ incubating ដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីននៅ 37 ° C (រូបភាពទី 1) ។យើងបង្ហាញថា gelation ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរនៃ α-helices ទៅជា β-layers និងការបង្កើត fibrils ដូច amyloid (រូបភាព 3 និង 4) ។ការរកឃើញនេះគឺគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលដោយសារតែ NTs ត្រូវបានរុំព័ទ្ធដោយបាច់ប្រាំ-helix រាងជារង្វង់ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាសម្រាប់ភាពរលាយខ្ពស់ និងស្ថេរភាពខ្ពស់នៅកំហាប់> 200 mg/mL នៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C អស់រយៈពេលជាច្រើនថ្ងៃ 27 ។លើសពីនេះ NTs ងាយស្រួលបត់ឡើងវិញបន្ទាប់ពីការប្រែពណ៌ដោយកំដៅនៅកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនទាបក្នុង µM ។យោងតាមលទ្ធផលរបស់យើង ការបង្កើតសរសៃត្រូវការការរួមបញ្ចូលគ្នានៃកំហាប់ប្រូតេអ៊ីន > 10 mg/mL និងសីតុណ្ហភាពកើនឡើងបន្តិច (រូបភាពទី 1)។នេះគឺស្របជាមួយនឹងគំនិតដែលថាសរសៃអាមីឡូអ៊ីដអាចបង្កើតបានពីប្រូតេអ៊ីនដែលបត់ជារាងជាសកលដែលស្ថិតក្នុងសភាពលាតត្រដាងដោយផ្នែកដោយសារតែការប្រែប្រួលកម្ដៅក្រោមលក្ខខណ្ឌសរីរវិទ្យា 48 ។ឧទាហរណ៏នៃប្រូតេអ៊ីនដែលឆ្លងកាត់ការបំប្លែងនេះរួមមានអាំងស៊ុយលីន 49,50, β2-microglobulin, transthyretin និង lysozyme51,52,53 ។ទោះបីជា NT គឺជា α-helix នៅក្នុងរដ្ឋកំណើតរបស់វាក៏ដោយ ក៏ប្រហែល 65% នៃខ្សែសង្វាក់ polypeptide គឺត្រូវគ្នាជាមួយនឹងការបង្កើតខ្សែរ៉ូតស្តេរីក (រូបភាព 4e) 45 ។ចាប់តាំងពីម៉ូណូមឺរមានលក្ខណៈចល័ត46 វាអាចបង្ហាញតំបន់អាមីឡូអ៊ីដហ្សែនដែលមានសក្តានុពលទាំងនេះនៅសីតុណ្ហភាពកើនឡើងល្មម ហើយនៅកំហាប់ខ្ពស់នៃប្រូតេអ៊ីនសរុបអាចឈានដល់កំហាប់សំខាន់សម្រាប់ការបង្កើតសរសៃអាមីឡូអ៊ីត54។បន្ទាប់ពីការវែកញែកនេះ យើងបានរកឃើញទំនាក់ទំនងអវិជ្ជមានរវាងការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ spidroin និងពេលវេលានៃការ gelation (រូបភាព 1c) ហើយប្រសិនបើការអនុលោមតាម monomeric NT ត្រូវបានរក្សាស្ថេរភាពដោយការផ្លាស់ប្តូរ (NT*, His-NT-L6) ឬដោយការបន្ថែមអំបិល អាចការពារការ ការបង្កើត hydrogels (រូបភាព 5) ។
ក្នុងករណីភាគច្រើន សរសៃអាមីឡូអ៊ីដបាត់ពីដំណោះស្រាយជាទឹកភ្លៀង ប៉ុន្តែនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌមួយចំនួន ពួកវាអាចបង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្សែល 55,56,57។ដុំសាច់ដែលបង្កើតជាអ៊ីដ្រូជែលជាធម្មតាមានសមាមាត្រខ្ពស់ និងបង្កើតជាបណ្តាញបីវិមាត្រដែលមានស្ថេរភាពតាមរយៈការជាប់គាំងម៉ូលេគុល 55,58 ស្របតាមលទ្ធផលរបស់យើង។សម្រាប់ការបង្កើតអ៊ីដ្រូជែលនៅក្នុង vitro ប្រូតេអ៊ីនជារឿយៗត្រូវបានលាតត្រដាងយ៉ាងពេញលេញ ឬដោយផ្នែក ឧទាហរណ៍ដោយការប៉ះពាល់នឹងសារធាតុរំលាយសរីរាង្គ សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ (70–90°C) និង/ឬ pH ទាប (1.5–3.0)59,60,61,62។សារធាតុ Spidroin hydrogels ដែលបានពិពណ៌នានៅទីនេះមិនតម្រូវឱ្យមានដំណើរការដ៏អាក្រក់នោះទេ ហើយក៏មិនតម្រូវឱ្យមានភ្នាក់ងារភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងដើម្បីរក្សាលំនឹងអ៊ីដ្រូហ្គេល។
វាត្រូវបានគេរាយការណ៍ពីមុនថា spidroin កើតឡើងម្តងទៀត និង QDs ដែលហាក់ដូចជាឆ្លងកាត់ការប្តូរសន្លឹកβ កំឡុងពេលបង្វិលសូត្រ បង្កើតជា hydrogels ។បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការរកឃើញរបស់យើង ពេលវេលា incubation និង/ឬ incubation temperatures គឺយូរជាង ឬខ្ពស់ជាងនេះរៀងៗខ្លួន ហើយ hydrogels លទ្ធផលគឺតែងតែស្រអាប់ (រូបភាពទី 7 និងតារាងបន្ថែម 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. បន្ថែមពីលើពេលវេលាជែលរហ័ស NT hydrogels >300 mg/mL (30%) ប្រសើរជាងប្រូតេអ៊ីនសូត្រពីងពាងដែលបានពិពណ៌នាផ្សេងទៀតទាំងអស់ ក៏ដូចជា hydrogels ធម្មជាតិដូចជា gelatin, alginate (2%), agar (0.5%) និងកូឡាជែន។(0.6%) (រូបភាពទី 7 និងតារាងបន្ថែម 1 និង 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74។
ពេលវេលាជែល និងម៉ូឌុលយឺតនៃអ៊ីដ្រូហ្គេលនៅក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងអ៊ីដ្រូហ្សែលដែលមានមូលដ្ឋានលើស្ពីដ្រូអ៊ីនផ្សេងទៀត និងអ៊ីដ្រូជែលធម្មជាតិដែលបានជ្រើសរើស។ឯកសារយោងត្រូវបានផ្តល់ឱ្យរួមជាមួយនឹងការពិពណ៌នាអំពីលក្ខខណ្ឌនៃ gelation ។APS Ammonium persulfate សីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ទិន្នន័យ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74។
សត្វពីងពាងហាក់ដូចជាបានបង្កើតវិធីដើម្បីការពារ spidroin ពីការ gelling កំឡុងពេលផ្ទុក។ទោះបីជាមានកំហាប់ខ្ពស់នៃប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងក្រពេញសូត្រក៏ដោយ ក៏តំបន់ដដែលៗដ៏ធំដែលទាក់ទងនឹងដែនស្ថានីយ មានន័យថាកំហាប់ជាក់ស្តែងនៃ NT និង CT នៅក្នុងក្រពេញនេះត្រូវគ្នានឹងប្រហែល 10-20 mg/ml នៅព្រំដែននៃការសិក្សានេះ។តម្រូវ​ការ​សម្រាប់​ការ​សង្កេត​ក្នុង​ការ​បង្កើត​អ៊ីដ្រូ​ហ្គេល​ក្នុង​ vitro ។លើសពីនេះទៀតកំហាប់ស្រដៀងគ្នានៃអំបិល 16 ស្ថេរភាព NT ដូចជានៅក្នុងក្រពេញសូត្រ (រូបភាព 5b) ។ការអនុលោមតាម NT ត្រូវបានសិក្សានៅក្នុង E. coli cytosol ហើយបានរកឃើញថាត្រូវបានបត់យ៉ាងតឹងរ៉ឹងជាងពេលដែលពិនិត្យនៅក្នុង vitro ដែលបង្ហាញបន្ថែមទៀតថាអំបិល ឬកត្តាផ្សេងទៀតរារាំងការប្រមូលផ្តុំរបស់វានៅក្នុង vivo ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សមត្ថភាពរបស់ NTs ក្នុងការបំប្លែងទៅជា β-sheet fibrils អាចមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបង្កើត filament ហើយគួរតែត្រូវបានស៊ើបអង្កេតនៅក្នុងការសិក្សានាពេលអនាគត។
បន្ថែមពីលើទិដ្ឋភាពប្រលោមលោកនៃ NT-amyloid-like fibril និងការបង្កើត hydrogel ដែលបានសង្កេតនៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងក៏បង្ហាញផងដែរថាបាតុភូតនេះអាចមានកម្មវិធីជីវបច្ចេកវិទ្យា និងជីវវេជ្ជសាស្ត្រ (រូបភាពទី 8) ។ជាភ័ស្តុតាងនៃគំនិត យើងបានផ្សំ NT ជាមួយ GFP ឬ PNP ហើយបានបង្ហាញថា ប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នាក៏បង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្គេលផងដែរនៅពេលភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេ ហើយប្រភាគ GFP និង PNP ភាគច្រើនរក្សាសកម្មភាពរបស់ពួកគេបន្ទាប់ពីការ gelation (រូបភាព 6) ។Nucleoside phosphorylases គឺជាកាតាលីករដ៏សំខាន់ដែលសំយោគនៃ nucleoside analogues75 ដែលធ្វើឱ្យការរកឃើញរបស់យើងពាក់ព័ន្ធសម្រាប់ឧស្សាហកម្មជីវឱសថ។គោលគំនិតនៃការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនលាយបញ្ចូលគ្នាដែលបង្កើតជាអ៊ីដ្រូហ្គេលថ្លាក្រោមលក្ខខណ្ឌអំណោយផលអនុញ្ញាតឱ្យបង្កើតអ៊ីដ្រូហ្គេលដែលមានមុខងារជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិអំណោយផលសម្រាប់កម្មវិធីជាច្រើនដូចជា អង់ស៊ីម immobilization ការបញ្ចេញថ្នាំដែលបានគ្រប់គ្រង និងវិស្វកម្មជាលិកា។លើសពីនេះ NT និង NT* គឺជាសញ្ញាសម្គាល់កន្សោមប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព 30 ដែលមានន័យថា NT និងបំរែបំរួលរបស់វាអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការផលិតប្រូតេអ៊ីនដែលរលាយក្នុងបរិមាណច្រើន និងការបង្កើតប្រូតេអ៊ីនគោលដៅដែលមិនមានចលនាជាបន្តបន្ទាប់នៅក្នុង 3D hydrogels ។
NT គឺរលាយ α-helical និងមានស្ថេរភាពនៅកំហាប់ទាប (µM) និង 37 ° C ។នៅសីតុណ្ហភាពដូចគ្នា ប៉ុន្តែក្នុងការកើនឡើងកំហាប់ (> 10 mg/ml) NT បង្កើតជា gels ដែលមានសរសៃដូចអាមីឡូអ៊ីត។ប្រូតេអ៊ីន NT fusion ក៏បង្កើតជា fibrillar gels ជាមួយនឹងបំណែក fusion មុខងារពេញលេញ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យប្រូតេអ៊ីនជាច្រើនត្រូវបាន immobilized នៅក្នុង hydrogels 3D ដោយប្រើ NT ។ខាងក្រោម៖ NT (PDB: 4FBS) និងរូបភាពនៃបណ្តាញសរសៃ និងរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធ (សន្មត់ និងមិនត្រូវបានគូរជាមាត្រដ្ឋាន GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210J/pdb4)។
សំណង់ (សូមមើលតារាងបន្ថែមទី 4 សម្រាប់បញ្ជីពេញលេញរួមទាំងលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូ) ត្រូវបានក្លូនទៅជា plasmid pT7 និងបំប្លែងទៅជា E. coli BL21 (DE3) ។E. coli ដែលមាន plasmids ដែលត្រូវបានកែច្នៃត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្នុងទំពាំងបាយជូរ Luria ដែលត្រូវបានបន្ថែមដោយ kanamycin (70 mg/l) ហើយលូតលាស់ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 30°C និង 250 rpm។បន្ទាប់មកវប្បធម៌ត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្នុងបរិមាណ 1/100 ទៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក LB ដែលមានផ្ទុកសារធាតុ kanamycin ហើយត្រូវបានដាំដុះនៅសីតុណ្ហភាព 30°C និង 110 rpm រហូតដល់ OD600 ឈានដល់ 0.8។សម្រាប់ការសិក្សា NMR បាក់តេរីត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងមធ្យម M9 អប្បបរមាដែលមាន 2 ក្រាមនៃ D-glucose 13C (Aldrich) និង 1 ក្រាមនៃ ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) សម្រាប់ការដាក់ស្លាកប្រូតេអ៊ីនជាមួយអ៊ីសូតូប។បន្ថយសីតុណ្ហភាពដល់ 20 អង្សាសេ ហើយជំរុញការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនជាមួយនឹង 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (កំហាប់ចុងក្រោយ) ។បន្ទាប់ពីការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនពេញមួយយប់ កោសិកាត្រូវបានប្រមូលផលនៅកម្រិត 7278×g, 4°C រយៈពេល 20 នាទី។គ្រាប់កោសិកាត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញក្នុងកម្រិត 20 mM Tris-HCl, pH 8 និងបង្កករហូតដល់ការប្រើប្រាស់បន្ថែមទៀត។កោសិការលាយត្រូវបាន lysed ដោយប្រើប្រាស់ cell disruptor (TS series machines, Constant Systems Limited, England) នៅ 30 kPa ។បន្ទាប់មក lysates ត្រូវបាន centrifuged នៅ 25,000 ក្រាម សម្រាប់ 30 នាទី នៅ 4 ° C ។សម្រាប់ NTMiSp បន្ទាប់មកគ្រាប់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញក្នុង 2 M អ៊ុយ, 20 mM Tris-HCl, pH 8, និង sonicated សម្រាប់ 2 នាទី (2 s បើក/បិទ, 65%) បន្ទាប់មក centrifuged ម្តងទៀតនៅ 25,000 xg, 4° C. ក្នុង 30 នាទីសារធាតុ supernatant ត្រូវបានផ្ទុកនៅលើជួរឈរ Ni-NTA លាងជាមួយ 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 ហើយទីបំផុតប្រូតេអ៊ីនត្រូវបាន eluted ជាមួយ 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 ។ ដើម្បីបង្កើត NT2RepCT និង NTCT, ការរំលាយអាហារ thrombin ណែនាំគេហទំព័រ (ThrCleav) រវាង His និង NT ។កន្លែងបំបែកសារធាតុ Thrombin ក៏មានវត្តមាននៅក្នុង His-NT-ThrCleav-2Rep (ផលិត 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ផលិត NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ផលិត CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ផលិត NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (ផលិត NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ផលិត NTF1Sp) និង His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ផលិត) NTMiSp។សំណង់ត្រូវបានរំលាយដោយសារធាតុ thrombin (1:1000) និង dialysis ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4° C. ជាមួយនឹង 20 mM Tris-HCl, pH 8 ដោយប្រើ Spectra/Por dialysis membrane ជាមួយនឹងកម្រិតទម្ងន់ម៉ូលេគុល 6-8 kDa ។បន្ទាប់ពីការលាងឈាម ដំណោះស្រាយត្រូវបានផ្ទុកនៅលើជួរឈរ Ni-NTA ហើយសារធាតុចម្រាញ់ដែលមានប្រូតេអ៊ីនចាប់អារម្មណ៍ត្រូវបានប្រមូល។ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់ដោយការវាស់ស្ទង់ការស្រូបកាំរស្មីយូវីនៅ 280 nm ដោយប្រើមេគុណផុតពូជនៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ លើកលែងតែ NTF1Sp ដែលបានប្រើការវិភាគ Bradford យោងទៅតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត។ភាពបរិសុទ្ធត្រូវបានកំណត់ដោយ SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis និង Coomassie ស្នាមប្រឡាក់ពណ៌ខៀវដ៏អស្ចារ្យ។ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយប្រើតម្រង centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ក្នុងកម្រិត 4000 xg ជាមួយនឹងការកាត់បន្ថយទម្ងន់ម៉ូលេគុល 10 kDa ក្នុងវដ្ត 20 នាទី។
រលាយ​សូលុយស្យុង​ប្រូតេអ៊ីន​ហើយ​បង្ហូរ​ដោយប្រុងប្រយ័ត្ន​ 150 µl ចូលទៅក្នុង​ 1ml clear septum vial (8 x 40 mm Thermo Scientific)។បំពង់ត្រូវបានបិទ និងផ្សាភ្ជាប់ជាមួយប៉ារ៉ាហ្វីលដើម្បីការពារការហួត។គំរូ (n = 3) ត្រូវបាន incubated នៅ 37 ° C ឬ 60 ° C និងដាក់បញ្ច្រាសជាទៀងទាត់ដើម្បីសង្កេតមើល gelation ។គំរូដែលមិនមានជែលត្រូវបាន incubed យ៉ាងហោចណាស់មួយសប្តាហ៍។កាត់បន្ថយចំណង disulfide NTMiSp ជាមួយនឹង 10 mM DTT ក្នុងមួយប្រូតេអ៊ីន 10 µM ។ដើម្បីវិភាគ gelation នៃថ្នាំកូតសូត្រពីងពាងធម្មជាតិ ពីងពាងស្ពានស៊ុយអែតត្រូវបានកាត់ ក្រពេញ ampullated សំខាន់ពីរត្រូវបានដាក់ក្នុង 200 μl នៃ 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ហើយកាត់ដើម្បីឱ្យថ្នាំកូតបំបែកចេញពីក្រពេញ។.មាតិកានៃក្រពេញត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន 50 μlសម្រាប់ការកំណត់ទម្ងន់ស្ងួត (ដោយការភ្ញាស់នៃដបបើកចំហនៅ 60 ° C ទៅទម្ងន់ថេរ) និង 150 μlសម្រាប់ gelation នៅ 37 ° C ។
ធរណីមាត្រ/ឧបករណ៍វាស់ត្រូវបានធ្វើពីដែកអ៊ីណុកដោយប្រើចានប៉ារ៉ាឡែលដែលមានអង្កត់ផ្ចិតខាងលើ 20 មម និងគម្លាត 0.5 ម។កំដៅគំរូពី 25 ° C ទៅ 45 ° C និងត្រឡប់ទៅ 25 ° C ក្នុងអត្រា 1 ° C ក្នុងមួយនាទីដោយប្រើបន្ទះបាតដែកអ៊ីណុក Peltier ។ការវាស់វែងរំញ័រត្រូវបានអនុវត្តនៅប្រេកង់ 0.1 Hz និងក្នុងតំបន់ viscoelastic លីនេអ៊ែរនៃសម្ភារៈក្នុងកម្រិត 5% និង 0.5% សម្រាប់គំរូ 100 mg/mL និង 300-500 mg/mL រៀងគ្នា។ប្រើបន្ទប់សំណើមផ្ទាល់ខ្លួនដើម្បីការពារការហួត។ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Prism 9 ។
សម្រាប់ការប្រមូលកាំរស្មីអ៊ីនហ្វ្រារ៉េដ (IR) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ពី 800 ទៅ 3900 សង់ទីម៉ែត្រ–1 ។ឧបករណ៍ ATR ក៏ដូចជាផ្លូវពន្លឺតាមរយៈ spectrometer ត្រូវបានសម្អាតដោយខ្យល់ស្ងួតមុន និងអំឡុងពេលពិសោធន៍។ដំណោះស្រាយ (500 mg/mL ដើម្បីកាត់បន្ថយកម្រិតកំពូលនៃការស្រូបយកទឹកក្នុងវិសាលគម) ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងគ្រីស្តាល់ ហើយជែល (500 mg/mL) ត្រូវបានបង្កើតឡើងមុនពេលវាស់ ហើយបន្ទាប់មកផ្ទេរទៅគ្រីស្តាល់ (n = 3)។ការស្កេន 1000 ត្រូវបានកត់ត្រាជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ 2 cm-1 និងសូន្យកាតព្វកិច្ច 2។ ដេរីវេទី 2 ត្រូវបានគណនាដោយប្រើ OPUS (Bruker) ដោយប្រើជួររលោងនៃប្រាំបួនចំណុច។វិសាលគម​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឱ្យ​មាន​លក្ខណៈ​ធម្មតា​ទៅ​តំបន់​រួម​គ្នា​នៅ​ចន្លោះ​ឆ្នាំ 1720 និង 1580 cm-1 ដោយ​ប្រើ F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” ។នៅក្នុង spectroscopy ATR-IR ជម្រៅនៃការជ្រៀតចូលនៃធ្នឹមអ៊ីនហ្វ្រារ៉េដចូលទៅក្នុងគំរូមួយគឺអាស្រ័យលើរលកលេខ ដែលបណ្តាលឱ្យមានការស្រូបទាញខ្លាំងនៅរលកលេខទាបជាងរលកខ្ពស់ជាង។ផលប៉ះពាល់ទាំងនេះមិនត្រូវបានកែតម្រូវសម្រាប់វិសាលគមដែលបង្ហាញក្នុងរូបភព។3 ដោយសារតែពួកវាតូចណាស់ (រូបភាពបន្ថែម 4) ។វិសាលគមដែលបានកែតម្រូវសម្រាប់តួលេខនេះត្រូវបានគណនាដោយប្រើកម្មវិធី Bruker OPUS ។
ជាគោលការណ៍ បរិមាណដ៏ទូលំទូលាយនៃការអនុលោមតាមប្រូតេអ៊ីនគឺអាចធ្វើទៅបានបន្ទាប់ពីការរំលាយសមាសធាតុដែលអាចទុកចិត្តបាននៅក្នុងកំពូល amide I ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ឧបសគ្គខ្លះកើតឡើងក្នុងការអនុវត្ត។សំលេងរំខាននៅក្នុងវិសាលគមអាចលេចឡើងជាកំពូល (មិនពិត) ក្នុងអំឡុងពេល deconvolution ។លើសពីនេះទៀត កំពូលភ្នំដោយសារតែការពត់ទឹកស្របគ្នានឹងទីតាំងនៃកំពូលភ្នំ amide I ហើយអាចមានទំហំប្រហាក់ប្រហែលគ្នាសម្រាប់សំណាកដែលមានបរិមាណទឹកច្រើន ដូចជាជែល aqueous ដែលបានសិក្សានៅទីនេះ។ដូច្នេះហើយ យើងមិនបានព្យាយាមបំបែកទាំងស្រុងនូវកំពូល amide I នោះទេ ហើយការសង្កេតរបស់យើងគួរតែត្រូវបានពិចារណាតែក្នុងការគាំទ្រវិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតដូចជា NMR spectroscopy ប៉ុណ្ណោះ។
ដំណោះស្រាយ 50 mg/ml NT និង His-NT2RepCT ត្រូវបានលាបពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។បន្ទាប់មក អ៊ីដ្រូជែលត្រូវបានពនឺជាមួយ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ដល់កំហាប់ 12.5 mg/ml, រង្គោះរង្គើឱ្យបានល្អ និងបំពង់ដើម្បីបំបែកជែល។បន្ទាប់មក អ៊ីដ្រូហ្គេលត្រូវបានពនឺ ១០ ដងជាមួយនឹង 20 mM Tris-HCl (pH 8) 5 μl នៃសំណាកត្រូវបានអនុវត្តទៅក្រឡាចត្រង្គទង់ដែងដែលស្រោបដោយ formvar ហើយសំណាកលើសត្រូវបានយកចេញដោយក្រដាសជូតមាត់។គំរូត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងជាមួយនឹងទឹក 5 µl នៃ MilliQ និងប្រឡាក់ដោយទម្រង់ uranyl 1% រយៈពេល 5 នាទី។យកស្នាមប្រឡាក់លើសចេញជាមួយក្រដាសស្រូបយក បន្ទាប់មកខ្យល់ស្ងួតសំណាញ់។ការថតរូបភាពត្រូវបានអនុវត្តនៅលើក្រឡាចត្រង្គទាំងនេះដោយប្រើ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ដែលដំណើរការនៅ 100 kV ។រូបភាពត្រូវបានថតក្នុងកម្រិត x 26,500 និង x 43,000 ដោយប្រើកាមេរ៉ា Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany)។សម្រាប់គំរូនីមួយៗ (n = 1) រូបភាព 10-15 ត្រូវបានថត។ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគរូបភាព និងការវាស់វែងនៃអង្កត់ផ្ចិតសរសៃ (n=100, សរសៃផ្សេងគ្នា)។Prism 9 ត្រូវបានប្រើដើម្បីអនុវត្ត t-tests ដែលមិនផ្គូផ្គង (ពីរកន្ទុយ) ។មធ្យម His-NT2RepCT និង NT fibrils គឺ 11.43 (SD 2.035) និង 7.67 (SD 1.389) nm រៀងគ្នា។ចន្លោះពេលទំនុកចិត្ត (95%) គឺ -4.246 ទៅ -3.275 ។ដឺក្រេនៃសេរីភាព = 198, p < 0.0001 ។
80 µl នៃសំណាករាវដែលមាន 10 µM thioflavin T (ThT) ត្រូវបានវាស់ជាបីដង (n = 3) ក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត ដោយប្រើបន្ទះបាតបាតខ្មៅ Corning 96-well black clear (Corning Glass 3881, USA)។ភាពខុសគ្នានៃពន្លឺត្រូវបានកត់ត្រាដោយប្រើតម្រងរំភើប 440 nm និងតម្រងបំភាយ 480 nm (FLUOStar Galaxy ពី BMG Labtech, Offenburg, Germany) ។សញ្ញា ThT មិន​ត្រូវ​បាន​ឆ្អែត ឬ​ពន្លត់​ឡើយ ព្រោះ​ការ​ពិសោធន៍​ជាមួយ​នឹង​កំហាប់​ផ្សេង​គ្នា​នៃ ThT ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​ដោយ​មិន​មាន​ការ​ផ្លាស់ប្តូរ​អាំងតង់ស៊ីតេ​នៃ​សញ្ញា។កត់ត្រាការស្រូបយកនៅ 360 nm សម្រាប់ការវាស់វែងអ័ព្ទ។សម្រាប់ការពិសោធន៍គ្រាប់ពូជ 100 mg/mL gels ត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C. ផ្អាកឡើងវិញ និងប្រើសម្រាប់ការបណ្តុះក្នុងសមាមាត្រ molar 5%, 10% និង 20% ។ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Prism 9 ។
បោះស្តុក His-NT2RepCT និង NT>100 mg/mL នៅលើទឹកកក ហើយត្រងតាមតម្រង 0.22 µm ។ការប្រមូលផ្តុំត្រូវបានគណនាដោយការវាស់ស្ទង់ការស្រូបយកនៅ 280 nm ដោយប្រើ Nanodrop ។នៅក្នុងអណ្តូងនៃចានមិនចងពណ៌ខ្មៅ 96 អណ្តូង (Corning) ជាមួយនឹងបាតច្បាស់លាស់ គំរូត្រូវបានពនឺដល់ 20 mg/ml ក្នុង 20 mM Tris-HCl pH 8 និងលាយជាមួយ 5 μM ThT (កំហាប់ចុងក្រោយ) ការប្រមូលផ្តុំគំរូសរុប បរិមាណ 50 μl។គំរូត្រូវបានថតរៀងរាល់ 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេលើមីក្រូទស្សន៍ CellObserver (Zeiss) ដែលមានឆានែលពន្លឺបញ្ជូន និងសំណុំតម្រងការរំភើប និងការបញ្ចេញឧស្ម័នរបស់ FITC សម្រាប់រូបភាព ThT ។កែវថត 20x/0.4 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការថតរូបភាព។Zen Blue (Zeiss) និង ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគរូបភាព។ជែលក៏ត្រូវបានរៀបចំពីដំណោះស្រាយ NT និង His-NT2RepCT ក្នុងកំហាប់ 50 mg/mL ដែលមានផ្ទុក 20 mM Tris pH 8 និង 5 µM ThT និង incubated នៅសីតុណ្ហភាព 37 °C រយៈពេល 90 នាទី។បំណែកជែលត្រូវបានផ្ទេរទៅអណ្តូងថ្មីដែលមាន 20 mM Tris, pH 8, និង 5 μM ThT នៅក្នុងចានបាតអណ្តូងខ្មៅ 96 ដែលមិនចងជាប់។ទទួលបានពន្លឺពណ៌បៃតង និងរូបភាពវាលភ្លឺក្នុងកម្រិតពង្រីក 20x/0.4។ImageJ ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគរូបភាព។
ដំណោះស្រាយ NMR spectra ត្រូវបានគេទទួលបាននៅ 310 K នៅលើ 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer ដែលបំពាក់ដោយ QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) ។សំណាក NMR ដែលមានប្រូតេអ៊ីនដូចគ្នា 10 mg/mL ដែលមានស្លាក 13C, 15N, រំលាយក្នុង 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .ការផ្លាស់ប្តូរគីមីនៃ NT2RepCT នៅ pH 6.7 ត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្តល់កម្រិតកំពូល 23 នៅក្នុងវិសាលគម 2D នៃ 15N-HSQC ។
មុំវេទមន្តបង្វិលរឹង NMR (MAS) វិសាលគមនៃ 13C, អ៊ីដ្រូហ្គេលដែលមានស្លាក 15N ត្រូវបានកត់ត្រានៅលើវិសាលគម Bruker Avance III HD នៅ 800 MHz ដែលបំពាក់ដោយឧបករណ៍ស្ទង់គ្មានអេឡិចត្រុង 3.2 mm 13C/15N{1H} ។សីតុណ្ហភាពគំរូត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយប្រើស្ទ្រីមឧស្ម័នសីតុណ្ហភាពអថេរនៅ 277 K។ ពីរវិមាត្រ dipole rotational resonance (DARR)76 និងការភ្ជាប់ឡើងវិញនូវប្រេកង់វិទ្យុ (RFDR)77 ត្រូវបានទទួលនៅប្រេកង់ MAS នៃ 12.5 kHz និង 20 kHz រៀងគ្នា។បន្ទាត់រាងប៉ូលឆ្លងកាត់ (CP) ពី 1H ដល់ 13C ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើជួរលីនេអ៊ែរពី 60.0 ទៅ 48.0 kHz នៅ 1H, 61.3/71.6 kHz នៅ 13C (នៅ 12.5/20 kHz MAS) និងពេលវេលាទំនាក់ទំនង 0.5–1 ms ។Spinal6478 decoupling នៅ 73.5 kHz ត្រូវបានប្រើកំឡុងពេលប្រមូលទិន្នន័យ។ពេលវេលានៃការទទួលបានគឺ 10 មីលីវិនាទី ហើយការពន្យាពេលវដ្តគឺ 2.5 វិនាទី។ទំនាក់ទំនង Cα/Cβ ដែលភ្ជាប់តែមួយដែលបានសង្កេតនៅក្នុងវិសាលគម RFDR ត្រូវបានកំណត់ដោយផ្អែកលើលក្ខណៈនៃការផ្លាស់ប្តូរគីមីប្រភេទសំណល់ និងទំនាក់ទំនងពហុតំណភ្ជាប់នៅក្នុងវិសាលគម DARR ។
មូលដ្ឋានទិន្នន័យ Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាយតម្លៃទំនោរ flutter និងថាមពល Rosetta សម្រាប់ NT, NTFlSp និង NTMiSp ។មូលដ្ឋានទិន្នន័យ Zipper គណនា Rosetta Energy80 ដែលរួមបញ្ចូលគ្នានូវមុខងារថាមពលឥតគិតថ្លៃជាច្រើនដើម្បីធ្វើគំរូ និងវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីន។កម្រិតថាមពលនៃ -23 kcal / mol ឬទាបជាងនេះបង្ហាញពីទំនោរខ្ពស់នៃជំងឺ fibrillate ។ថាមពលទាបមានន័យថាស្ថេរភាពបន្ថែមទៀតនៃ β-strands ពីរនៅក្នុងការអនុលោមតាមខ្សែរ៉ូត។លើសពីនេះ ក្បួនដោះស្រាយ Waltz ត្រូវបានប្រើដើម្បីទស្សន៍ទាយតំបន់ amyloidogenic នៅក្នុង NT, NTFlSp និង NTMiSp Ref ។81. (https://waltz.switchlab.org/).
ដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីន NT ត្រូវបានលាយជាមួយអាស៊ីត 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer នៅ pH 5.5 និង 6.0 ដើម្បីបន្ថយ pH ទៅ pH 6 និង 7 រៀងគ្នា។កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនចុងក្រោយគឺ 100 មីលីក្រាម / មីលីលីត្រ។
ការវាស់វែងត្រូវបានអនុវត្តនៅលើឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ស៊ីឌី J-1500 (JASCO, សហរដ្ឋអាមេរិក) ដោយប្រើ 300 μL cuvette ដែលមានផ្លូវអុបទិក 0.1 សង់ទីម៉ែត្រ។ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានពនឺទៅ 10 μM (n = 1) ក្នុង 20 mM phosphate buffer (pH 8) ។ដើម្បីវិភាគស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងវត្តមាននៃអំបិលប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានវិភាគនៅកំហាប់ដូចគ្នា (n = 1) ក្នុង 20 mM ផូស្វាតសតិបណ្ដោះអាសន្ន (pH 8) ដែលមាន 154 mM NaF ឬ NaCl រៀងគ្នា។ការស្កេនសីតុណ្ហភាពត្រូវបានកត់ត្រានៅ 222 nm ពី 25 ° C ដល់ 95 ° C ជាមួយនឹងអត្រាកំដៅ 1 ° C / នាទី។សមាមាត្រនៃប្រូតេអ៊ីនបត់ពីកំណើតត្រូវបានគណនាដោយប្រើរូបមន្ត (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal)។លើសពីនេះទៀត 5 វិសាលគមត្រូវបានកត់ត្រាសម្រាប់សំណាកនីមួយៗពី 260 nm ទៅ 190 nm នៅ 25 ° C និងបន្ទាប់ពីកំដៅដល់ 95 ° C ។វិសាលគមចំនួនប្រាំត្រូវបានជាមធ្យម ធ្វើឱ្យរលោង និងបំប្លែងទៅជារាងពងក្រពើ។ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Prism 9 ។
អាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៃ His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ត្រូវបានវាស់ជា triplicate (n = 3) ក្នុង 96-well Corning plates ជាមួយនឹងបាតថ្លាខ្មៅ (Corning Glass 3881, USA) នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌឋិតិវន្ត។វាស់សំណាកជាមួយឧបករណ៍អានចានដែលមានមូលដ្ឋានលើហ្វ្លុយអូរីស ជាមួយនឹងរលកនៃការរំភើបនៃ 395 nm និងកត់ត្រាការបំភាយនៅ 509 nm មុនពេល gelation និង 2 ម៉ោងក្រោយមកនៅ 37 ° C ។ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគជាមួយ Prism 9 ។
ឧបករណ៍វិភាគសកម្មភាព phosphorylase សារធាតុ Purine nucleoside (វិធីសាស្ត្រ fluorometric, Sigma Aldrich) ត្រូវបានប្រើតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ដើម្បីវាស់ស្ទង់សកម្មភាពនៅក្នុងជែល និងដំណោះស្រាយដែលមាន His-NT-PNP លាយ 10 ng នៃ His-NT-PNP ជាមួយ 100 mg/mL NT ទៅនឹងបរិមាណសរុប 2 µL ពីព្រោះជែលផ្តល់សញ្ញានៅខាងលើចន្លោះពេលរកឃើញនៃសំណុំ។ការគ្រប់គ្រងសម្រាប់ជែល និងដំណោះស្រាយដោយគ្មាន His-NT-PNP ត្រូវបានរួមបញ្ចូល។ការវាស់វែងត្រូវបានអនុវត្តពីរដង (n = 2) ។បន្ទាប់ពីសកម្មភាពត្រូវបានវាស់ ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានដកចេញ ហើយជែលថតរូបដើម្បីធានាថាជែលនៅដដែលក្នុងអំឡុងពេលវាស់។ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Prism 9 ។
សម្រាប់ព័ត៌មានបន្ថែមអំពីការរចនាការសិក្សា សូមមើល Nature study abstract ភ្ជាប់ទៅអត្ថបទនេះ។
រូបភាពទី 1 និងទី 2 បង្ហាញពីទិន្នន័យដំបូង។1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, និង 6, រូបបន្ថែម។3, រូបភពបន្ថែម។5a, d, រូបភពបន្ថែម។6 និងរូបភពបន្ថែម។8. ទិន្នន័យទិន្នន័យពីការសិក្សានេះត្រូវបានបង្ហោះនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យ Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ។ទិន្នន័យ NMR ដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានបង្ហោះទៅកាន់ឃ្លាំង BMRBig ក្រោមលេខសម្គាល់ធាតុ bmrbig36 ។រចនាសម្ព័ន្ធរបស់ GFP និង PNP ត្រូវបានយកចេញពី PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) ។
Rising, A. and Johansson, J. Spinning សូត្រពីងពាងសិប្បនិម្មិត។ជាតិគីមី។ជីវវិទ្យា។11, 309–315 (2015)។
Babb, PL et al ។ហ្សែន Nephila clavipes បង្ហាញពីភាពចម្រុះនៃហ្សែនសូត្រពីងពាង និងការបញ្ចេញមតិដ៏ស្មុគស្មាញរបស់ពួកគេ។ពូជពង្សជាតិ។49, 895–903 (2017) ។